关键词：cf-DNA；分子模式（DAMP）；生信分析；

引言

血浆中的线粒体DNA损伤相关分子模式(mtDNA DAMPs)与多种疾病的发病机制和预后密切相关。目前主流的qPCR检测方法存在诸多局限性，如易受核基因组线粒体插入序列干扰、检测范围有限等问题。

虽然全基因组测序可能克服这些局限，但血浆中mtDNA含量过低难以达到理想测序深度。

为此，研究团队开发了一种新型RNA靶向捕获方法，结合WGS和生物信息学分析，旨在实现对血浆mtDNA的准确定量、片段分布分析、序列来源识别及变异检测。并在四名重度创伤患者的血浆样本中进行了验证，为血浆mtDNA的深入研究提供了新的技术手段。

图1 文献介绍

今天的文献解读专栏给大家带来的是2021年发表在Research Square期刊的：“Quantitation and Characterization of Cell-Free Mitochondrial DNA in Plasma by Deep Sequencing”。

材料与方法

样本量与样本来源

研究获得南阿拉巴马大学机构审查委员会批准。纳入4名创伤中心STICU的患者，入选标准为年龄≥18岁且入住STICU时损伤严重程度评分(ISS)≥15。四人均为男性，年龄19-42岁。其两名患者接受大量输血(>15U)，两名ISS相似的患者无需输血。还将来自生物样本库的mtDNA低于qPCR检测限或存在的mtDNA为全长(未片段化)的血浆样本用于片段长度比较。

血浆处理与DNA提取

血浆样本采用700g(4℃)离心5分钟处理，随后使用QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit(Qiagen)从200μl血浆中分离DNA，最终储存于75μl洗脱缓冲液中(-80℃)。

文库构建与mtDNA富集

研究团队使用KAPA Hyper Prep Kit进行DNA文库构建。使用1.5X AMPure XP磁珠(Beckman Coulter)纯化DNA后进行11个循环的文库扩增，再次纯化并储存于30μl EB中。为富集线粒体DNA，采用MyBaits Human Global Panel mtDNA进行捕获，将7μl文库与RNA mtDNA探针在55℃杂交40小时，后用Dynabeads MyOne Streptavidin C1捕获RNA-DNA杂交产物。后经8个循环PCR富集，用KAPA Library Quantification kit进行定量，并通过Bio-Rad Bioanalyzer分析文库质量。

测序与数据预处理

第一批两个样本使用HiSeq2000采用2x50bp双端测序，平均读数达1.03×108±7.46×106；第二批两个样本在HiSeq2500完成，同样采用2x50bp双端测序，平均读数为3.14×107±8.70×106。原始数据首先通过Cutadapt v2.10去除接头序列，然后使用Sentieon v201911.01的BWA-MEM与GRCh38参考基因组进行比对，比对后的读段通过"sentieon util sort"进行排序并转换为bam格式。

比对流程模拟验证

为评估NUMT对比对流程准确性的影响，研究团队采用读段模拟的方法进行验证。首先使用Bedtools v2.26.0在非多态性NUMT的上下游各添加100bp侧翼区域，并合并100bp内的区间，得到699个剩余区间。基于实际样本的片段大小参数，使用Art Illumina Q Version 2.5.8模拟读段，采用HiSeq 2500错误模型，设置读长50bp，插入片段大小100±25bp。

对线粒体序列、合并的NUMT序列和已知的多态性NUMT序列进行读段模拟，覆盖度均设为1,000。通过计算假阴性误差百分比(预期丢失的线粒体读段数量与实际覆盖100个读段位点之比)和假阳性误差百分比(NUMT读段错误比对到线粒体基因组的数量)来评估比对准确性。

NUMT分析与变异检测

使用NCBI Nucleotide Blast 2.6.0在GRCh38基因组中鉴定NUMT，参数设置为：以人类线粒体序列作为查询序列，词长度9，奖励值1，惩罚值-1，开放间隙2，延伸间隙2。共识别出1521个NUMT，总覆盖长度达1.03×105bp。

变异检测采用Bcftools 1.11-19进行，设定最大测序深度1000，仅考虑碱基质量≥20且比对质量≥20的位点。对于高覆盖度位点(≥500×)和中等覆盖度位点(10-500×)分别制定变异判定标准，所有变异通过NCBI变异服务API添加dbSNP标识符。

数据分析与统计方法

研究团队使用JMP Genomics 8.0进行Spearman等级相关分析，数据可视化通过Pythonv3.7.9环境下的Pandas、Numpy、Matplotlib和Seaborn等库完成。

研究结果

研究为建立一个分析流程，全面表征细胞游离血浆mtDNA DAMPs，最终实现将mtDNA DAMPs作为疾病预后的生物标志物。而首要挑战要克服分析低丰度、高度片段化的mtDNA相对于数量更大的核DNA池的限制。

在实验分析中，首先从患者200 µl血浆中提取总DNA，获得平均浓度为221 ± 193 ng/µl的DNA样本。与正常人血浆中DNA片段(>7000 bp)相比，创伤患者的血浆DNA呈现高度片段化特征，大多数约为150 bp或更短。为克服技术难题，研究采用RNA靶向捕获富集试剂盒。通过对四个样本进行WGS和靶向捕获的比较分析，发现富集样本中mtDNA的序列覆盖度显著提高。但在分析中发现了数量异常大的异质性，这需进一步探讨NUMTs的影响。

图2 正常人类受试者与创伤患者的差异比较 a) 通过生物分析仪测定正常人和创伤患者血浆中游离DNA片段大小。正常受试者血浆含有较长片段，而创伤患者血浆含有明显较小的DNA片段。 b) 展示富集前后血浆DNA片段与线粒体基因组的比对情况，注意到多个异质性变异。

模拟分析显示线粒体基因组中存在14个与核基因组完全同源的区域，其中12个长度超过100bp，这些区域主要集中在染色体1附近。而在线粒体基因组9.5-16.5kb区域中NUMT污染相较于其他区域明显较少。

图3 模拟mtDNA和NUMT序列读段分析 a) 展示与线粒体基因组比对的模拟mtDNA和NUMT读段，发现14个无法区分的位点。 b) 展示NUMT和线粒体基因组序列高度同源重叠区段。 c) 以箱线图展示不同映射质量下的假阴性和假阳性百分比。

为提高分析准确性，研究团队将序列数据重新比对到完整的GRCh38人类参考基因组。结果显示，比对到线粒体基因组的NUMT序列总量超过了真实mtDNA序列的比对量。通过斯皮尔曼等级相关分析评估序列捕获富集效果，发现配对的富集和未富集样本之间相关性较差，而同一患者不同时间点的富集样本间相关性较高。与WGS相比，该富集和比对策略实现了1488 ± 1045（平均值±标准差）倍的富集。

图4 靶向捕获富集与NUMT排除分析 a) 展示生物信息学处理后mtDNA片段的富集情况。 b) 分析单个大量输血患者输血前后的片段覆盖度相关性。 c) 比较三个患者富集前后的富集效率。

通过分析138个已知插入位点的平均覆盖度，研究团队发现了13个潜在的多态性NUMT位点，其中3个NUMT基因型得到确认。这些发现表明，RNA靶向探针不仅可以捕获mtDNA，还能捕获多态性NUMTs及其附近的核DNA序列。通过检测这些区域的测序覆盖度，可以识别患者特异性的多态性NUMTs。

图5 多态性NUMT插入位点分析 a) 展示靶向捕获如何导致多态性NUMT侧翼区域的测序。 b) 展示两个患者中特定多态性NUMT的差异。 c) 展示读段部分比对到核基因组，部分比对到线粒体基因组的情况。 d) 分析多态性NUMT侧翼区域与线粒体基因组的同源性。

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讨论

图6 文献讨论

UMT分析策略

研究提出了区分mtDNA和NUMTs重叠信号的策略。NUMTs包括参考基因组中已收录的和多态性两种类型。通过序列变异和NUMT邻近区域的覆盖度来处理这两类NUMTs，研究发现多态性NUMTs在总mtDNA DAMP池中只占很小且稳定的比例。

测序特征分析

深度测序方案使研究能够确定血浆mtDNA DAMPs的片段长度分布和异质性特征。即使在样本数量有限的情况下，也能检测到平均片段大小随患者和入院后时间的变化。研究还检测到多个随时间变化的异质性变异，表明无细胞血浆mtDNA中的异质性特征可能发展成为器官功能障碍的新型标志物。

研究局限与发现

尽管患者数量有限制约了研究的生物学意义，但研究仍发现输血和非输血患者之间存在显著差异，包括平均mtDNA丰度的变化。研究还注意到NUMT覆盖度在患者间相对一致，可作为标准化mtDNA DAMP丰度的新颖因素。

总结

本研究提出了一个新的实验和分析工作流程，相比当前方法能够以更高的准确性和敏感性评估血浆无细胞mtDNA DAMP的特征。研究结果强调了在进行mtDNA定量分析时必须考虑NUMTs的影响，并采用适当的分析策略来确保结果的准确性。