基于血清外泌体的蛋白质组学研究确定乳腺癌的诊断特征和治疗靶点

期刊名称：Cancer Research                        

影响因子：12.5

期刊分区：JCR 1区/中科院1区        

发表时间：2024年6月

作者单位：复旦大学人类表型组研究院、复旦大学附属肿瘤医院、复旦大学附属中山医院

相关疾病：乳腺癌         

样本类型：血清外泌体（EVs）

其他信息：病例对照研究、疾病诊断标志物、治疗靶点、临床建模

1.前言

今天跟大家分享一篇研究乳腺癌（BC）的文章。该文章于2024年6月发表在Cancer Research（IF=12.5）杂志上，标题为“Proteomic Profiling of Serum Extracellular Vesicles Identifies Diagnostic Signatures and Therapeutic Targets in Breast Cancer”。作者利用基于DIA的定量蛋白质组学技术检测了发现队列中的BC患者（n=126）和健康供者（HDs，n=70）的血清外泌体（EVs），并在五个独立队列中验证了研究结果，构建了特异性EV蛋白分类器，用于诊断BC和区分转移性疾病患者。值得注意的是，TAIDO1被发现是BC远处转移的EVs生物标志物。该研究表明由乳腺癌患者外泌体（BC-EVs）携带的蛋白质可以作为一种新的微创液体活检工具，用于BC早期诊断，及区分是否为淋巴结远处转移，且TALDO1的药理学失活是转移性BC的潜在治疗方法。

2.研究背景

乳腺癌（BC）是全球最常见的癌症之一，占女性癌症的30%。对BC患者转移状态的早期检测和动态评估对于治疗和分析癌症对治疗反应具有重要价值。与传统肿瘤组织活检相比，利用患者血液中的分子信号（如EVs）开展液体活检具最小侵袭性、更少并发症和更高的动态监测能力。

目前，关于人类样本的EVs蛋白质组数据有限，对BC特异性EVs特征及其组成缺乏全面的了解，对其独特的BC生物标志物缺乏共识。因此，作者开展了这项病例对照研究，检测了BC患者和健康供者的血清外泌体（EVs）样本，筛选用于早期诊断和区分转移性疾病患者的新型生物标志物。该研究为BC的早期诊断和转移性疾病鉴别提供了新的思路。

2.实验设计

图1 研究流程

3.实验结果

（1）乳腺癌来源EVs的蛋白质组特征

研究团队通过超速离心法（UC）结合的尺寸排阻色谱法（SEC）纯化了发现队列中196份血清EVs（图2 A）。此外，根据五个独立队列进行了验证（图2 B）。透射电镜（TEM）结合纳米粒子追踪分析（NTA）结果显示：分离纯化的外体大小约30-200nm，呈圆形或圆形囊泡，可见明显的膜结构，符合外泌体形态大小特征（图2 C和D）。在分离的EVs中检测到了EV标记CD9、CD63、TSG101和ALIX，而没有检测到阴性的外显子标记calnexin（图2 E）。这些结果表明，EVs从血清中得到了很好的分离和高度纯化。

接下来，作者将EV蛋白数据库Vesiclepedia的蛋白信息和本研究提取的蛋白进行比较，发现HD中有7446个EV与数据库重叠，占比高达90.4%；而BC组有8282个蛋白重叠，占比94%。该结果说明提取的EV纯度很高（图2 F）。同时，其鉴定到的蛋白90%与细胞外功能相关，且Vesiclepedia的前100种EV相关蛋白中，99%在这项研究中被鉴定出来，表明了数据的可靠性（图2 G）。

图2 乳腺癌来源EVs的蛋白质组特征

（2）BC来源EVs表现出与免疫应答代谢和转移相关的特异性特征

接下来，作者对蛋白质组数据进行了生物信息学分析，以确定BC患者血清EVs的蛋白质组学特征。在HD和BC组间筛选获得了1130个差异表达蛋白（DEPs）。其中，有767个蛋白在BC患者血清EVs中显著上调表达，363个蛋白显著下调（图3 A）。

对DEPs进行通路富集分析，发现在HD血清EVs中显著上调的通路包括：蛋白水解、受体介导的内吞作用、吞噬，识别和囊泡介导的运输；在BC患者血清EVs中显著上调的信号通路包括：细胞-细胞粘附、糖酵解/糖异生、细胞外基质组织、血管生成和抗原加工和呈递等（图3 B和C）。该结果表明，BC患者血清EVs中显著上调的蛋白表现出与免疫反应、代谢和转移相关的特征（图3 C）。这些发现表明，BC患者和HD血清EVs的蛋白质组不同，BC细胞释放的EVs可能携带更多的包裹货物进行信号传递，从而诱导受体细胞的恶性转化。

图3 BC来源EVs表现出与免疫应答代谢和转移相关的特异性特征

（3）区分BC的7-蛋白诊断模型

为了评估筛选获得的DEPs是否可以作为BC液体活检工具，作者使用XGBoost机器学习法对模型进行训练和测试。根据样本来源（BCvsHD）对EVs样本进行均匀分割，将70%的样本作为训练集，剩余30%作为内部测试集。通过五折交叉验证训练集，获得了一个由7个蛋白（IGHV3-23、MMP9、AHNAK、PAICS、VWF、ANGPTL6和PSME1）组合而成的分子分类器（命名为7-蛋白质分类器）（图4 D和E）。基于受试者工作特征曲线（ROC）分析，在训练集中，7-蛋白质分类器对BC诊断的灵敏度和特异度分别为93.2%和93.9%（图4 F和G）。将7-蛋白质分类器应用于内部测试集，对BC诊断的灵敏度为81.6%，特异度为85.7%（图4 F和H）。此外，作者还收集了41例血清EVs样本（Shanghai验证队列#1）（乳腺良性肿瘤，n=17；其他癌症类型，n=12；BC，n=12）作为外部测试集，进行相同方法的质谱检测，7-蛋白质分类器可以很好地区分BC患者，灵敏度和特异度分别为91.7%和93.1%（图4 I）。

此外，作者收集了42例其他类型的癌症患者血清EVs样本作为外部验证队列（Fujian验证队列），从发现队列中随机抽取10个HD样本，使HD和其他不同癌症类型样本的比例相当。ROC分析结果显示，7-蛋白质分类器对诊断BC具有特异性，不适用于诊断其他类型的肿瘤。

图4 区分BC的7-蛋白诊断模型

（4）从四种临床亚型BC中提取的EVs的蛋白质组特征

由于BC是一种高度异质性疾病。为了区分不同临床亚型BC的蛋白质组图谱，作者运用主成分分析了队列中来自Luminal A（20例）、Luminal B（50例）、Her2-enriched（21例）和TNBC（23例）的EV样本。结果表明不同临床亚型BC样本之间存在明显差异（图5 A）。接下来，作者确定了110、40、67和139个EV蛋白，它们分别在Luminal A、Luminal B、Her2-enriched和TNBC样本中显著高表达（图5 B）。利用ConsensusPathDB和DAVID数据库对这些蛋白进行富集分析，富集到的生物过程和通路各不相同（图5 C）。

图5 从四种临床亚型BC中提取的EVs的蛋白质组特征

（5）BC淋巴结转移的12-蛋白诊断模型

作者运用ExtraTrees机器学习法，基于EVs蛋白评估其作为乳腺癌（BC）淋巴结转移液体诊断工具的潜力。将EVs样本按来源（BC-LN-与BC-LN+）均匀分割，70%为训练集，30%为内部测试集。经五折交叉验证训练集，构建了由12个蛋白组成的分子分类器（12-蛋白质分类器）。在训练集上，该分类器对BC淋巴结转移诊断的灵敏度为100%，特异性为89.4%；在内部测试集上，灵敏度为93.8%，特异性为81.3%。此外，使用CPTAC BC数据集（n=75）作为外部验证测试集，12-蛋白质分类器的灵敏度和特异性均达100%。

图6 BC淋巴结转移的12-蛋白诊断模型

（6）潜在与不良预后相关的BC远端转移标志物TALD01

作者分析了28例乳腺癌样本（7例导管原位癌和21例远端转移）的蛋白质组学特征，寻找远端转移相关生物标志物。通过DAVID通路注释发现，远端转移样本中局灶黏附、代谢相关通路及补体和凝血级联等通路显著上调，且24种EVs蛋白质显著上调表达，可能是潜在血清EVs蛋白质标志物。

作者认为理想的生物标志物应该在相应的肿瘤组织中过表达并释放到血液中。因此，作者进一步比较了BC患者的血清EVs蛋白质组和BC组织蛋白质组。作者在Tang等人的BC队列（n=118）中检查了上述24种潜在的BC远端转移的EVs蛋白标志物。结果表明，其中10种EVs蛋白质（FLNA、VTN、PKM、PDHB、G6PD、TALDO1、LDHB、ACACA、C7和F2）在BC组织中高表达，并与预后不良相关（图7 C和D）。其中，4种EVs蛋白质（TALDO1、FLNA、VTN和C7）是BC远端转移的潜在特异性生物标志物（图7 D）。值得一提的是，与HD、DCIS、BC-LN-和BC-LN+相比，TALDO1在BC远端转移患者的血清EVs中显著上调（图7 D）。

为验证TALDO1与远端转移的关系，作者收集了Shanghai验证队列#2，包含36个正常组织、36个原发组织和16个远端转移组织样本。经免疫组织化学分析，远端转移组织中TALDO1高强度表达比例远高于原发和正常组织，表明TALDO1是潜在的乳腺癌远端转移标志物。

图7 潜在与不良预后相关的BC远端转移标志物TALD01

（7）TALD01是BC转移的关键调节因子

作者从TALDO1过表达的4T1细胞和普通4T1细胞中分离EVs并进行DIR标记，将表达荧光素酶-GFP的4T1细胞皮下注射到BALB/c小鼠中建立BC异种移植模型。7天后，通过尾静脉注射DIR标记的TALDO1-EVs或对照EVs处理小鼠，当肿瘤体积达20 mm³时，每隔一天注射一次。15天后，用IVIS Lumina成像系统评估肿瘤区域DIR荧光强度。结果显示，TALDO1-EVs组肿瘤区域EVs明显增加，肿瘤体积显著大于对照组，且肺部的苏木精和伊红染色显示TALDO1-EVs组小鼠肺损伤更明显，表明EVs-TALDO1在乳腺癌进展中起关键作用。

图8 TALD01是BC转移的关键调节因子

（8）发现治疗BC的强效TALDO1抑制剂AO-022

作者通过高通量分子对接技术从271,380个小分子中筛选出能抑制TALDO1的小分子化合物，发现AO-022能显著提高TALDO1的热稳定性，表明其与TALDO1相互作用。AO-022能剂量依赖性地抑制MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力，降低胞外酸化率，抑制NADPH生成和核苷酸合成。在裸鼠模型中，AO-022显著抑制MDA-MB-231异种移植物的肿瘤生长，且对小鼠体重无显著影响。此外，AO-022还能抑制转移性BC PDOs的生长，表明其对乳腺癌具有潜在的治疗效果。

图9 发现治疗BC的强效TALDO1抑制剂AO-022

4.结论

本研究基于DIA的蛋白质组学定量方法检测收集到的血清外泌体（EVs）样本，通过构建EV蛋白分类器，为乳腺癌（BC）的早期诊断、淋巴结转移评估和远处转移监测提供了新的非侵入性液体活检工具，有望改善BC患者的预后。TALDO1作为BC远处转移的潜在生物标志物，为BC的诊断和预后提供了新的生物标志物，有助于早期发现和干预远处转移。通过筛选和验证TALDO1抑制剂AO-022，该研究为乳腺癌的治疗提供了新的潜在靶点，为开发新的治疗策略提供了科学依据。

5.编者总结

本研究采用病例对照设计，将蛋白质组学技术应用于乳腺癌(BC)的早期诊断、淋巴结转移评估和远处转移监测研究，具有重要临床价值。研究的主要创新性发现包括:

1.构建了宝贵的EVs蛋白质组资源库:通过对196例血清EVs样本进行全面的蛋白质组学分析，鉴定出大量与乳腺癌相关的EV蛋白，为后续研究提供了重要的数据基础。

2.开发了基于机器学习的诊断与评估模型:应用XGBoost和随机森林等机器学习方法，成功构建了基于EV蛋白的乳腺癌诊断及淋巴结转移评估分类器，展示了机器学习在生物标志物发现中的应用潜力。

3.发现并验证了TALDO1作为转移生物标志物:发现TALDO1是潜在的远处转移生物标志物，其生物学功能在体外实验中得到证实，并在体内实验中进行了验证，为乳腺癌诊断和预后提供了新思路。筛选并验证了靶向TALDO1的潜在治疗策略:利用高通量分子对接和虚拟筛选技术，成功筛选出TALDO1的别构抑制剂AO-022，并通过体内外实验证实了其对乳腺癌进展的抑制作用，提示了新的潜在治疗靶点。

该研究为进一步探索乳腺癌提供了重要的方向和思路，未来研究可重点关注以下方面:

1.扩大样本验证与普适性研究:在现有样本基础上，扩大样本量并纳入更多样化的群体(如不同种族、疾病阶段)，以增强研究结论的普适性和可靠性。

2.评估TALDO1的长期预后价值:开展长期随访研究，深入评估TALDO1作为生物标志物在乳腺癌患者中的长期预后意义及其动态变化规律。

3.解析TALDO1的作用机制:深入探究TALDO1在乳腺癌细胞信号通路中的具体作用机制及其与其他分子的相互作用网络。

4.推进A0-022的临床转化:在现有体内外实验基础上，通过大规模临床试验进一步验证A0-022在临床应用中的安全性和有效性。

文献原文：

Xu G, Huang R, Wumaier R, et al. Proteomic Profiling of Serum Extracellular Vesicles Identifies Diagnostic Signatures and Therapeutic Targets in Breast Cancer. Cancer Res. 2024;84(19):3267-3285. doi:10.1158/0008-5472.CAN-23-3998