重组gp41抗原在酶免平台中的应用（二）

一、        中国HIV病例起源

  1985年中国首例输入性HIV病例出现，患者是一名34岁的美籍阿根廷游客，长期居住在美国，是一名确诊的HIV患者，入境后因持续高烧、呼吸困难入住北京协和医院，患者表现出典型的艾滋病晚期症状，包括卡氏肺孢子虫肺炎（PCP），X光显示弥漫性肺间质浸润。医院经血清检测，确认其HIV抗体阳性，并伴有严重的免疫缺陷。尽管医院尝试联系美国医生获取治疗药物Pentamidine（喷他脒），但患者于1985年6月6日因中毒性休克和呼吸循环衰竭死亡。后续医院对患者使用过的物品进行焚烧处理，并保留病理切片以供研究。

1986年国内首例HIV诊断病例出现，患者是一名36岁的男性华侨，原籍福建，曾在美国工作多年，1986年11月回国求医，患者出现体重骤减、持续腹泻、发热等症状，经福建省立医院检测，HIV抗体呈阳性，确诊为艾滋病。患者转入福州市传染病医院隔离治疗，但病情恶化，于1987年2月26日死亡。

1990年首例中国大陆居民艾滋病病例出现，患者是一名51岁的男性医生，曾于1985-1986年在欧洲工作，1990年4月发病，患者出现肺炎、神经系统症状，血清抗HIV-1阳性，最终确诊为艾滋病，CD4细胞极低。感染途径可能是因职业暴露（如手术感染）或性接触传播，但具体途径未完全明确。

我国HIV传播的大致线索以20世纪80年代末期，沿海开放城市的特殊人群向内地传播扩散，传播途径以性传播和云南等地的静脉注射毒品导致，到了20世纪90年代中期，HIV由特殊人群向一般人群迅速扩散，进入高速增长期蔓延期，1995年全国有31个省份报告发现HIV病例，同时一些地方发现母婴传播病例，中原几个省份出现了经血液传播的HIV大爆发。

这些HIV早期病例的发现为中国艾滋病的防控和研究提供了重要依据，也推动了相关政策的制定，如1986年卫生部成立艾滋病预防工作小组，1990年卫生部宣布成立国家艾滋病委员会，2006年我国开始施行《艾滋病防治条例》。

二、        HIV血液检测方法的起源

1983年法国巴斯德研究所的科学家吕克•蒙塔尼和他的学生巴尔-西诺西共同从一名法国时装设计师Frederic Brugiere的淋巴结中分离出了一种病毒叫淋巴结病相关病毒（lymphadenopathy associated virus,LAV)，研究成果发表在1983年5月20日的《Science》上。吕克•蒙塔尼因在艾滋病的研究和防控领域做出了巨大贡献，为他赢得了科学界的声望和诺贝尔奖的认可。

一年后，美国国家癌症研究所罗伯特•盖洛博士在1984年5月4日的《Science》上也发表了他领导的团队的成果，他们发现的病毒叫T细胞白血病/淋巴结病3B型病毒（T-cell leukaemia/lymphoma virus type IIIB，HTLV-III）。HTLV-III后被证实与法国蒙塔尼埃团队1983年发现的LAV为同种病毒，1986年统一命名为HIV（人类免疫缺陷病毒）。

关于HIV最早的检测试剂这个话题，一直有个公案有待考证，据称1983年9月法国吕克•蒙塔尼就开发出了检测血液中是否含有艾滋病毒的检测方法，并申请英国专利，当月吕克•蒙塔尼前往美国冷泉港参加会议报告了LAV的研究进展，他把LAV病毒株交给了美国国立癌症研究所的罗伯特•加洛博士，并签署了一份合同，声明加洛实验室只能用作学术研究，不能用作商业途径。同年12月，吕克•蒙塔尼将HIV检测方法向美国专利局提交专利申请，然而专利迟迟未被授权。1984年4月23日美国卫生与公众服务部部长玛格丽特•赫克勒宣布：美国国立癌症研究所的罗伯特•加洛博士及其团队已发现艾滋病的病因——一种逆转录病毒，命名为 HTLV-III。赫克勒同时宣布加洛团队开发出可识别HTLV-III的诊断性血液检测方法并申请了专利。1985年5月，美国专利局授予加洛HIV检测专利，而早几个月申请的巴斯德研究所却没能获得专利。1985年12月，巴斯德研究所向美国法庭起诉，控告加洛实验室和美国国家癌症研究所违反合同，将他们提供的LAV株用于商业用途，要求把检测专利授予巴斯德研究所。这场官司持续了一年多，惊动了美国总统里根和法国总统密特朗，在他们的主持下，双方于1987年3月底达成协议，平分专利费。

总的来说，20世纪80年代后期，由于法国吕克•蒙塔尼团队和美国罗伯特•盖洛团队的出色工作，使得HIV能够通过血液被检测出来，有力推动了全球HIV防疫事业。

三、        酶联免疫法在HIV早期检测中的应用

1984年美国国家癌症研究所（NCI）向五家公司提供了HTLV-III（HIV）病毒样本，用于合作开发血液筛查检测方法，这五家公司是：雅培（Abbott Laboratories）1985年3月推出全球首个商用HIV抗体检测试剂盒（HTLV-III ELISA）率先通过FDA批准；奥索（Ortho Diagnostics，强生子公司）开发了竞争性ELISA检测法，1985年推出Western Blot确认试剂；杜邦（DuPont）参与早期试剂开发，后退出HIV检测市场；拜耳（Bayer）通过子公司Bio-Rad推出HIV抗原检测技术；基因泰克（Genentech）参与重组蛋白技术研发，后转向HIV治疗药物领域（未推出检测试剂）。病毒样本由NCI的Robert Gallo团队提供，为H9/HTLV-III细胞系（可连续生产病毒）。

世界上最早的商业化HIV检测试剂是由美国雅培（Abbott）公司开发的HIV EIA（酶联免疫法）试剂盒，于1985年3月获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，成为全球首个用于筛查献血者HIV抗体的诊断测试技术。

该试剂采用间接ELISA法，检测血液中的HIV抗体，包被抗原为体外培养的H9/HTLV-III细胞裂解抗原。由于早期细胞裂解抗原纯度较低，而且含有H9细胞表达的HLA-II类抗原（如HLA-DR4），导致ELISA假阳性（孕妇等群体）灵敏度和特异性有限，窗口期约为3个月。

就当是情况而言，雅培检测试剂的推出极大降低了输血传播HIV的风险，被美国红十字会等机构迅速采用。它标志着科学防治艾滋病的重大突破，为后续HIV检测技术的发展奠定了基础。雅培的这一开创性工作不仅推动了HIV检测技术的进步，也极大提升了全球血液安全水平。

四、        总结

雅培（Abbott）的第一代HIV EIA试剂盒（HTLV-III EIA）使用H9/HTLV-III细胞系的病毒裂解物抗原包被微孔板，裂解物中包含HIV结构蛋白（如gp41、p24、p55）和宿主细胞蛋白（H9细胞的HLA-II类抗原等），由于裂解物抗原gp41纯度很低，导致灵敏度有限，窗口期长达3个月，另外特异性也较差，假阳性问题严重，假阳性的主要来源是HLA-II类抗体（孕妇占假阳性72.7%）、疟疾抗体（非洲）、自身免疫抗体（抗核抗体等）。雅培第一代HIV检测试剂的不足也直接催生了HIV重组抗原的出现。

为了解决试剂灵敏度和特异性问题，雅培在HIV重组抗原和反应模式上不断创新，引领了全球HIV检测的最高水平。1990年，第二代HIV酶免检测试剂问世，仍然采用间接法，采用重组的gp41或人工合成多肽进行包被，明显提高了准确性。1994年，第三代酶免试剂出现，用双抗原夹心法代替了间接法，微孔板包被有重组的gp41、gp120和gp36抗原，也有厂家包被了gp160抗原，标记抗原采用同样的抗原类型，由于第三代HIV试剂可以检出IgM，检出窗口期较第二代EIA试剂平均提前了5天，以雅培的第三代EIA试剂为例，窗口期为22天。1998年，第四代酶免试剂出现，可同时检测HIV-1 p24抗原和HIV抗体，微孔板包被重组的gp41、gp120和gp36抗原和p24抗体，标记同类型的抗原和p24抗体，窗口期缩短为18天。

综上所述，HIV酶免检测试剂的迭代过程和HIV抗原的性能提升相依相伴，这其中gp41抗原序列及表达纯化工艺的优化功不可没。

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