背景介绍

    藏药材独一味（Phlomoides rotata）为唇形科糙苏属多年生矮小草本，无茎，具粗厚伸长的根茎；叶片常4枚辐状对生，轮伞花序密集呈头状，小坚果包被于宿萼内。独一味形态特征适配高寒环境生长，主要分布于喜马拉雅山、喀喇昆仑山脉、帕米尔高原等区域，生长在海拔3900-5100米的高寒草原、森林边缘、河谷碎石滩等极端高寒生境。恶劣环境不仅塑造了其顽强的生存适应机制，更促使其积累独特活性化学成分。作为传统藏药核心物种，其兼具重要药用价值与经济潜力，现代研究已证实藏药材独一味具有明确的止血、抗炎等药理作用。目前，学界围绕该物种的资源分布、化学组成、临床应用及遗传多样性开展系统研究，发现其地上部分活性成分含量显著高于根系。目前，药典已明确将藏药材独一味的地上部分指定为药用来源。因此，深入研究其地上部分（尤其叶片）具有重要的学术与应用价值。

    代谢组学（metabolomics）诞生于上个世纪末，是一门研究生命体对外界刺激、病理生理变化以及本身基因突变而引起的小分子的代谢产物（内源性代谢物）种类、数量及其变化规律的科学，是转录组学和蛋白质组学的延伸，能够更直接、更准确地反映生物体的生理状态，是系统生物学的重要组成部分。细胞内的大量生命活动发生在代谢层面，相对于基因组和蛋白组，代谢组学更接近于表型。代谢组学自诞生来获得飞速发展，被广泛应用于疾病诊断、药物研发、食品营养、毒理、环境、植物等领域。通过代谢组技术分析实验组与对照组的代谢水平差异，找出差异代谢物，有助于筛选或研究差异代谢物参与的生物过程，揭示其参与的生命活动机制，完成调控通路等方面的研究。从检测方式上，代谢组学主要分为非靶向分析（untargeted）和靶向分析（targeted）两类。其中，非靶向分析通常是建立在高分辨质谱仪上，依赖其强大的高分辨率质量分析器，能够对样本中的各类代谢物进行无偏向、大规模、系统性的检测，最大程度反映生物体内的代谢水平变化情况。

    在藏医药现代化研究中，代谢组学技术为传统药用植物的功效验证与优质资源筛选提供了科学手段。例如针对藏药独一味，该技术已被用于探究海拔、坡向等生长条件对其叶片代谢物组成及相关通路的影响，为精准筛选药理作用最优的药用资源奠定理论基础。

iplant链接：独一味 Phlomoides rotata|iPlant 植物智——植物物种信息系统

藏药材独一味（Phlomoides rotata）

研究进展

1、“Bentley, et al. , 2019” 该文章使用非靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术分析了从三个不同气候区域采集的耐干燥药用灌木Myrothamnus，在叶绿叶材料中共检出41种疑似酚类化合物，以类黄酮为主，其中9种为花青素。研究发现不同地区叶片松酚的显著差异。

2、“Stierlin, et al. , 2020” 研究采用了自动热解吸-气相色谱-质谱（ATD-GC-MS）技术通过动态顶空提取分析薰衣草。从薰衣草中提取和挥发物的田间分析表明，代谢组学技术可以有效识别复杂田间环境中受感染植物与健康植物之间的化学差异。

3、“Rashid, et al. , 2021” 该研究基于GC-MS对来自不同环境的两种大麻种子进行了非靶向代谢组学研究，共检测到236种代谢物。43种代谢物间差异具有统计学意义（P ≤ 0.05）。证实环境对大麻种子的抗氧化和营养价值有显著影响。

4、“李志军, et al. , 2008” 通过利用色谱技术对独一味的地上部分进行分离纯化，并根据理化性质和光谱分析鉴定了化合物的结构。从叶片的乙醇提取物中分离出12种化合物，并检测小鼠巨噬细胞RAW264.7的NO释放活性。研究发现，独一味的抗炎机制可能与抑制NO生物合成有关，该机制的活性成分主要是类黄酮而非环烯醚萜类成分。

5、“委员会, 2010”在2010年版的《中华人民共和国药典》中，将Phlomoides rotata的指定来源从“全草”修改为“地上部分”。因此，深入研究Phlomoides rotata的地上部分具有重要意义.

论文标题：Analysis of metabolic differences in Tibetan medicinal plant Phlomoides rotata leaves in different habitats based on non-targeted metabolomics（基于非靶向代谢组学的藏药用植物Phlomoides rotata叶片在不同生境的代谢差异分析）

作者：Lele Wang, Hongli Wang, Junlin Chen, Yuzhen Lamu,Xiangyang Qi, Lei Lei, Kangshan Mao and Sonam Tso（通讯作者）

作者第一单位：青藏高原生物多样性与环境教育部重点实验室

独一味是一种传统的藏药草本植物，以其抗炎和镇痛特性而闻名，在异质环境中表现出独特的代谢物谱。然而，海拔和坡向对其次级代谢的影响仍然知之甚少。本研究旨在表征不同海拔和微气候条件下独一味叶片中的代谢物变化，为其质量评价和可持续利用提供理论基础。采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术（LC-MS）进行代谢组学分析。在中国西藏自治区山南市曲松县布丹拉山，采集了三个海拔梯度（4300米、4600米、5000米）和两个坡向（南坡与北坡）的叶片样品。共检测到2331种代谢物，其中脂类（41.93%）、有机含氧化合物（13.95%）和苯丙素类（12.4%）使代谢物谱中的主要成分。海拔梯度引起了5种差异累积代谢物（DAMs）的显著变化，包括原花青素B2和二氢香豆素。坡向影响了17种DAMs，如2,3-裂环皂苷元和2-O-α-D-吡喃半乳糖基-1-脱氧野尻霉素。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，海拔特异性富集于黄酮生物合成和泛酸/辅酶A生物合成，而与坡向相关的DAMs则富集于甘油磷脂代谢和半乳糖代谢。海拔驱动的黄酮类（如原花青素B2）增加可能反映了对紫外线辐射和氧化应激的适应性反应。与坡向相关的代谢物变化，特别是甘油磷脂，可能与温度和湿度方面的微气候差异有关。这些发现强调了环境因素在塑造独一味的代谢表型中的关键作用，并对药理活性化合物生物合成具有影响。已鉴定的差异累积代谢物可作为质量控制的潜在生物标志物，而通路分析为保护和栽培实践中的代谢工程提供了靶点。

关键词：藏药、Phlomoides rotata、代谢组学、海拔梯度、坡度、差异代谢物

链接：Frontiers | Analysis of metabolic differences in Tibetan medicinal plant Phlomoides rotata leaves in different habitats based on non-targeted metabolomics

发表杂志：Frontiers in Plant Science

主要科学问题

1、不同海拔、不同坡向下野生独一味叶片中的非靶向代谢物存在怎样的差异？

2、差异代谢物合成的相关代谢途径是什么？

研究方法

1、提取独一味叶片中的代谢物并通过LC-MS/MS对提取液进行检测。

2、处理LC-MS/MS原始数据并进行主成分分析（PCA）和偏平方判别分析（PLS-DA），以及评估模型稳定性的七周期交互验证。

3、对比KEGG数据库对代谢物的合成途径和功能进行分类。

创新点

1、聚焦海拔和坡向两个关键环境因子，探究其对独一味叶片代谢物及代谢通路的影响，为理解该植物在异质环境下的代谢调控机制提供了新的思考。

2、采用LC-MS技术，对西藏山南市特定区域的3个海拔梯度和2个坡向的独一味叶片开展代谢组学分析，明确了原花青素B2（PB2）、2,3-secoporrigenin等关键差异积累代谢物。

3、通过KEGG富集分析，明确了海拔特异性富集的黄酮类生物合成、泛酸/辅酶A生物合成通路等多个代谢通路，初步揭示代谢物变化与植物适应紫外线辐射、温湿度差异等环境条件的关联。

主要结论

1、通过人类代谢数据库（HMDB）检索，共检测到2331种代谢物

    通过HMDB检索，代谢物中的脂质及类脂分子占比最高，为41.93%。这类物质不仅在调节细胞正常生理功能中具有重要作用，还在植物响应盐胁迫、干旱胁迫、温度胁迫等非生物胁迫过程中发挥关键生理功能。其次为有机含氧化合物、苯丙素和聚酮类化合物、有机酸及其衍生物、有机杂环化合物，各类占比均超10%。其中苯丙素和聚酮类化合物占比12.40%，其代谢物对植物生长发育，及植物与环境的相互作用具有重要调控功能；有机酸及其衍生物占比11.33%，参与了重要的三羧酸循环，并广泛应用于植物抗逆调节。

代谢物分类统计占比图

2、对数据的相关性分析

    不同海拔样品的PCA与PLS-DA分析结果显示：南坡、北坡3个海拔梯度的代谢物谱在PC1与PC2维度均存在差异，其中南坡的总贡献率为29.80%，北坡为25.50%。虽可观察到样品的总体分布趋势，但3组样品间存在明显交叉，需采用更有效的模型解析其代谢差异。进而通过PLS-DA模型对组间差异进行分析，分析表明，南坡 R²=0.9809、北坡 R²=0.8642；随着置换保留率的降低，Q²回归线呈上升趋势，表明该模型通过置换检验。

不同海拔的PCA分析图

不同海拔的PLS-DA分析图

    南北坡海拔分组样品的PCA分析显示，其代谢物谱在PC1与PC2维度均呈现一定差异，但组间样品存在明显交叉，需采用更有效的模型揭示代谢差异。继而通过PLS-DA模型分析，结果表明，高海拔、中海拔、低海拔组的R²分别为0.9905、0.9906、0.9938；随着置换保留率的降低，Q²回归线呈上升趋势，该模型通过置换检验。

不同斜率方向的PCA分析图

不同斜率方向的PLS-DA分析图

3、对显著差异代谢物的筛选

    南坡不同海拔共检测到2种特征代谢产物，分别为PB2和二氢香豆素（dihydrocoumarin）；北坡不同海拔的特征代谢产物为3种，即预苯酸、M-羟基苯丙酮酸及2-（3-羧基丙酰基）-6-羟基环己烷-2,4-二烯羧酸。

南北坡条形图上不同海拔的叶片差异代谢产物比较

    采用火山图分析同一海拔南北坡叶片样本的次生代谢产物差异，结果显示：高海拔组（HIGH-S_vs_HIGH-N）鉴定出7种显著差异代谢物，其中1种上调、6种下调；中海拔组（MIDDLE-S_vs_MIDDLE-N）鉴定出2种显著差异代谢物；低海拔组（LOW-S_vs_LOW-N）鉴定出8种显著差异代谢物，包括4种上调和4种下调。

南北坡3个海拔高度的Phlomoides rotata叶片间代谢产物差异的火山图

4、对差异代谢物的通路分析

    不同海拔的差异代谢物主要富集于7条代谢途径。南坡3个海拔梯度共筛选出4条显著差异代谢途径，即黄酮生物合成、泛酸盐和辅酶A合成、色氨酸代谢及单杆菌生物合成；北坡则鉴定出3条显著差异代谢途径，分别为单巴坦生物合成、柠檬烯和蒎烯降解、苯丙烷生物合成。而南坡最显著的差异代谢途径为黄酮生物合成，其产物黄酮类化合物具有多种重要生物学功能，既是植物色素的主要来源，也对人体健康具有潜在益处。北坡最显著的差异代谢途径为单萜生物合成，环境温度升高、中度干旱可促进单萜类化合物生成，紫外线亦能提高其产量。

南北坡不同海拔处金丝叶代谢产物的KEGG富集图

    不同坡度的差异代谢物主要富集于11条代谢通路。其中甘油磷脂代谢相关差异表现为：高海拔组（HIGH-S_vs_HIGH-N）仅鉴定出1条显著差异代谢途径；中海拔组（MIDDLE-S_vs_MIDDLE-N）鉴定出6条显著差异代谢途径，分别为类黄酮生物合成、柠檬酸盐循环（TCA 循环）、鞘脂代谢、丙氨酸-天冬氨酸和谷氨酸代谢、抗坏血酸和醛酸盐代谢、戊糖和葡萄糖醛酸盐的相互转化；低海拔组（LOW-S_vs_LOW-N）鉴定出4条显著差异代谢途径，即半乳糖代谢、甘氨酸-丝氨酸和苏氨酸代谢、赖氨酸降解、半胱氨酸和蛋氨酸代谢。

南北坡不同坡向的Phlomoides rotata叶代谢产物的KEGG富集

个人评述：

    本文通过对比不同海拔和不同坡向两种环境因子对独一味叶片中的代谢物组成和代谢通路的差异进行分析，利用非靶向代谢组技术对差异代谢物进行识别筛选，揭示独一味代谢物与环境因子之间的关联。该思路与技术方法同样适用与对野生珍稀、濒危植物以及药用植物的分析和保护，通过对比不同因素，明确植物与环境之间的关系，为分析和保护野生植物及其生长环境提供参考。