目的基因和载体的双酶切与连接

思考题解答

1. 在吸取限制性核酸内切酶的时候如何操作才能避免浪费？

吸取时应使用无菌、无酶的吸头，操作迅速且精准，避免反复吹打；酶一般需最后加入反应体系，且加入后轻弹离心管混匀，减少酶的残留浪费；同时注意酶的保存条件，避免因保存不当导致酶失活而浪费。

2. 酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？

有影响。若体积过大，酶的浓度相对降低，可能导致酶切效率下降；体积过小则反应体系内各组分混合不均，且容易因局部温度变化影响酶活性，从而影响酶切效果。合适的体积能保证酶与底物充分接触，维持酶的最佳催化环境。

3. 假设一种限制性内切酶在重组质粒上有两个酶切位点，如果酶切后的电泳显示有三条带，分析可能的原因，并采取何种措施解决？

可能原因是酶切不完全，部分质粒未被完全切割，导致出现超螺旋质粒、线性化质粒和未完全酶切的质粒三种条带。解决措施：可适当增加酶的用量、延长酶切时间或提高酶切温度（在酶的耐受范围内），确保酶切完全。

4. 为什么要采用16℃下连接？

T4 DNA连接酶在16℃时活性较高，且此温度下DNA分子的黏性末端能较好地保持互补配对状态，有利于连接反应的进行，同时避免因温度过高导致DNA分子结构不稳定或连接酶活性下降。