引言

做大肠杆菌研究的第八年，我越来越觉得 “体外实验” 和 “体内真相” 之间隔着一道看不见的墙：想研究细胞分裂必需的蛋白，敲除株活不了，RNAi 敲低效率时高时低，数据根本没法复用；好不容易纯化出复合物，却发现体外结合状态和体内 Co-IP 结果对不上。

这些 “卡壳时刻” 不是个例 —— 必需蛋白碰不得、蛋白互作 “体外失真”、突变体表型 “知其然不知其所以然”，几乎是每个大肠杆菌研究者都会遇到的坎。直到 2018 年看到《Molecular Systems Biology》上那篇把 TPP 技术用到细菌上的文章，再到 2020 年《Nature》发布的规模化 TPP 数据集，我才突然意识到：原来这些困扰多年的难题，早就有了 “无创破解” 的思路。

接下来，我就跟大家一起聊聊这两篇文章怎么帮我跳出 “体外实验的陷阱”，重新看懂大肠杆菌的蛋白世界。

2018 年《Mol Syst Biol》—— 第一次觉得 “体外实验的苦没白受”

我最早知道 TPP 是在 2017 年的学术会议上，当时听人说能测活细胞里蛋白的热稳定性，第一反应是 “这对大肠杆菌有用吗”？毕竟我们做革兰氏阴性菌，细胞壁难破，膜蛋白又容易变性，之前试过多重蛋白酶解，结果一团糟。所以看到 2018 年这篇文章时，我第一时间翻的是 “方法学” 部分。

解决最头疼的“技术适配” 问题

作者团队太懂细菌研究的痛点了：他们用溶菌酶+ 0.8% NP-40 裂解细胞，而不是我之前用的 2% SDS——SDS 虽然裂解彻底，但会让膜蛋白变性，导致热稳定性数据完全不准。更贴心的是，他们还对比了 NP-40 和 SDS 的效果，发现两者提取的膜蛋白比例没差异，这一下就打消了我的顾虑。

还有温度梯度的设置，他们选了42-87℃，而不是哺乳动物细胞常用的 37-60℃。我之前傻乎乎地照搬过 37-60℃，结果大部分大肠杆菌蛋白都没熔化，还以为是技术问题。后来才知道，大肠杆菌的外膜蛋白比如TolC（多药外排泵复合物的外膜通道亚基，负责将药物 / 毒素排出细胞外），能扛到 87℃，难怪之前的数据没信号。这篇文章相当于给细菌 TPP 画了个 “操作手册”，我后来按这个方法做，第一次就检测到了 1500 多个蛋白的熔化曲线，当时激动得差点打翻离心管。

重新认识“蛋白复合物的真实状态”

我之前研究 AcrAB-TolC 外排泵，一直以为这三个蛋白在体内是稳定结合的 —— 毕竟体外能纯化出复合物。但这篇文章的 TPP 数据显示，AcrB（内膜）的熔化温度是 58℃，而 TolC（外膜）是 72℃，两者根本不同步。作者解释说，跨区室的复合物其实是“动态组装” 的，AcrB 在膜上形成亚复合物，只有当药物存在时才会和 TolC 结合。

看到这里我突然想起，之前做 Co-IP 时，只有加了四环素，才能拉到 AcrB 和 TolC 的互作 —— 当时以为是药物促进了结合，现在才明白，是 TPP 揭示了 “动态组装” 的真相。这比单纯的体外纯化有价值多了，毕竟活细胞里的蛋白，不可能像试管里那样一直待在一起。

抗生素机制研究终于“不止于靶点”

我博士期间做过氨苄西林的靶点鉴定，当时用下拉实验找到了 PBP3（青霉素结合蛋白），就以为万事大吉了。但这篇文章用 TPP 发现，氨苄西林不仅稳定了PBPs，还让核糖体亚基的热稳定性下降了。作者推测，这是因为细胞壁合成受阻，导致翻译也受影响 —— 这一下就把 “细胞壁合成” 和 “翻译” 两个看似无关的过程连起来了。

如果只靠传统方法，我永远不会知道抗生素的 “连锁反应” 这么复杂，更别说找到下游的应激通路了。

2020 年《Nature》——原来大肠杆菌研究还能“这么玩”

2020 年这篇《Nature》出来的时候，我正在为 “必需蛋白研究” 发愁。当时想做某靶点的功能，可它是细胞分裂必需基因，敲除株根本活不了，只能做 RNAi，结果敲低效率忽高忽低，数据没法用。看到这篇文章说 “60% 的必需蛋白热稳定性会变”，我立刻停下手头的实验，花了 3 天把全文精读了一遍。

必需蛋白研究的“破冰时刻”

作者的发现太颠覆了：他们测了273 个必需蛋白，只有 22% 的丰度有变化，但 60% 的热稳定性会变。比如 ParC（拓扑异构酶 IV 亚基），在 ΔclpS 突变株里热稳定性升高，在 ΔphoP 突变株里又下降 ——而且这种变化和它的活性直接相关：热稳定性升高时，ParC 的拓扑异构酶活性增强；下降时活性减弱。

最关键的是，他们用 CRISPRi 验证了：在野生型细胞里，把 ParC 的表达量降 8 倍，细胞还能长；但在 ΔclpS 突变株（ParC 热稳定）里，只要降 2 倍，细胞就死了（合成致死）。这一下就给我指了条明路：不用敲除，也不用敲低，只要看必需蛋白的热稳定性变化，就能推断它的活性。

终于能给“孤儿蛋白” 贴标签了

我们实验室有个传统，每年都会从生信分析里挑 10 个 “孤儿蛋白”（功能未知）来研究，之前靠同源序列比对，结果一半都不对。这篇文章用 TPP 做了个 “共变化分析”：计算1764 个蛋白在 121 个突变株里的 Spearman 相关性，发现功能相关的蛋白会 “一起变”。

比如 YqjX：此前功能未知的 “孤儿蛋白”，但它和铁硫簇合成蛋白（IscA、IscS）的热稳定性相关性 rₛ=0.58，而且在 ΔiscA 突变株里，YqjX 的热稳定性也下降了 —— 作者据此推测 YqjX 参与铁硫簇代谢。后来按这个思路研究 YbaB（功能待验证），发现它和 RecR（DNA 重组修复蛋白） 的丰度、热稳定性都高度相关，而且在 UV 处理后，两者的热稳定性都会升高，最终证实其功能是 DNA 修复相关蛋白。这种“用体内共变化找功能” 的方法，比体外实验靠谱多了，毕竟蛋白的功能最终要在细胞里体现。

突变体表型的“黑箱” 被打开了

研究者做过 ΔmdtK突变株的药敏实验，发现它对二甲双胍敏感，当时想当然地认为是 MdtK 泵没了，药物排不出去。但TPP 数据显示，ΔmdtK 突变株里，不仅 MdtK 没了，还有 5 个代谢酶的热稳定性变了—— 其中MaeA的热稳定性下降，导致苹果酸积累，而苹果酸会促进二甲双胍进入细胞（可能通过改变细胞膜电位或与药物竞争转运体）。

原来耐药性是 “泵 + 代谢” 共同决定的！后来补做了实验：在 ΔmdtK 突变株里过表达 MaeA，发现二甲双胍的敏感性下降了 30% ——这要是只看MdtK，永远不会发现代谢酶的作用。还有 ΔtolC 突变株对氨曲南的耐药性，也是因为OmpF的热稳定性下降（构象改变导致通道关闭或效率降低），药物进不去 ——这些“隐藏” 的机制，只有 TPP 能揪出来。

总结| TPP 技术重塑大肠杆菌研究的三大维度

作为亲历者，我深刻感受到这两篇文献带来的 “思维革命”。TPP 技术之所以能破解大肠杆菌研究的传统难点，核心在于它实现了三个 “转变”：

▶ 从“破坏型研究” 到 “无创型检测”：无需敲除、无需纯化，在活细胞内直接捕捉蛋白的真实状态，让必需蛋白、瞬时互作不再 “碰不得、看不见”。

▶从“单一指标” 到 “多维数据”：同时检测丰度和热稳定性，丰度反映 “蛋白有多少”，热稳定性反映 “蛋白在干什么”，两者结合实现了 “量” 与 “效” 的统一。

▶从“个案分析” 到 “系统解析”：规模化数据集让蛋白功能、代谢网络、药物机制的研究从 “单个基因” 扩展到 “全基因组网络”，加速了未知功能基因的注释和表型机制的破解。

最后说句心里话

做微生物研究这么多年，我最怕的就是 “用体外实验套体内结论”—— 比如纯化个蛋白就说它在细胞里是这么作用的，敲除个基因就说表型是它导致的。但 TPP 让我明白，活细胞里的蛋白世界比我们想象的复杂得多：必需蛋白的活性靠热稳定性调控，蛋白复合物是动态组装的，突变体表型是蛋白网络共同决定的。

这两篇文献最可贵的不是技术多先进，而是它们教会我 “从细胞的角度看问题”—— 不再是我们想让蛋白怎么变，而是看蛋白在细胞里实际怎么变。现在我每次设计实验前，都会先去http://ecoliTPP.shiny.embl.de（2020 年文献公开的 TPP 数据库，可查询 121 个突变株中蛋白的丰度和热稳定性数据）查一下相关蛋白的 TPP 数据，少走了很多弯路。

如果你也在研究大肠杆菌，建议你也试试 TPP—— 不用怕技术复杂，2018 年的文章已经把方法铺好了；也不用怕数据多，2020 年的数据库能帮你省很多事。毕竟做研究最幸福的时刻，就是发现一项技术，能让你看到之前看不到的真相。

首个蛋白质组水平无偏倚药物靶点筛选方法助力微生物研究

▶全面捕获微生物体内蛋白真实功能状态：蛋白质组水平覆盖微生物必需蛋白、蛋白复合物亚基、代谢酶；无需裂解细胞或纯化蛋白，原位检测蛋白热稳定性（直接反映体内互作、配体结合及活性状态），避免体外实验失真

▶多种数据分析策略适配微生物研究需求：结合蛋白熔化曲线（Tm）分析、Spearman 共变化分析及 limma 差异分析，全面挖掘遗传扰动或环境应激下的微生物蛋白功能关联

▶多数据库联动辅助微生物蛋白功能解析：整合微生物专属数据库及公开 TPP 数据集，辅助孤儿蛋白功能注释、代谢通路重构及突变体表型机制溯源

▶多种衍生技术适配微生物研究场景：除常规温度范围（TPP-TR，适配微生物不同生长阶段 / 应激条件，如指数期 vs 稳定期呼吸酶变化）、遗传扰动 - 热稳定性关联（2D-TPP，如微生物突变株全蛋白组分析）外，还可进行单温度点（ITSA）、多温度点混合（PISA）等高通量技术，用于微生物耐药机制筛查、环境适应性蛋白挖掘

参考资料

[1] Mateus A, Bobonis J, Kurzawa N, et al. Thermal proteome profiling in bacteria: probing protein state in vivo. Mol Syst Biol. 2018;14(7):e8242. Published 2018 Jul 6. doi:10.15252/msb.20188242

[2] Mateus A, Hevler J, Bobonis J, et al. The functional proteome landscape of Escherichia coli. Nature. 2020;588(7838):473-478. doi:10.1038/s41586-020-3002-5