CRISPR文库筛选揭炎症机制！海星生物助免疫靶点发现

炎症因子IL-1β的异常调控与慢性炎症、自身免疫病等多种疾病密切相关，但其背后的遗传调控网络仍有诸多未知。艾伯维公司（AbbVie Inc.）基因组学研究中心借助全基因组CRISPR敲除文库筛选技术，在人源单核细胞系中系统性鉴定出295个IL-1β调控基因，并深入解析了TNRC18基因座通过表观遗传调控炎症信号的全新机制，为免疫相关疾病的治疗提供了重要靶点。而海星生物（HySigen）依托自主研发的CRISPRSeek™文库筛选平台，可提供全方位CRISPR文库筛选服务，让这类高通量功能基因组学研究高效落地，加速疾病机制解析与靶点发现。

一、核心研究方法—CRISPR文库筛选

1.细胞模型选择：采用人源单核细胞系U937的衍生株U937-LC3-Cas9+，该细胞稳定表达Cas9和LC3自噬报告基因，经PMA诱导分化后可模拟巨噬细胞功能，对LPS刺激产生炎症应答，高效分泌IL-1β。

2.CRISPR文库与递送：选用Broad Institute的Brunello全基因组sgRNA文库，含76441条sgRNA，覆盖19114个人类蛋白编码基因（每个基因4条sgRNA）及1000条非靶向对照sgRNA；以MOI=0.3的低感染效率转导细胞，确保单个细胞仅整合1条sgRNA，文库覆盖率充足。

3.筛选流程设计：转导后经嘌呤霉素筛选获得稳定细胞库，PMA诱导分化后用LPS刺激24小时，通过流式细胞术（FACS）分选IL-1β低表达（IL-1βlow）和高表达（IL-1βhigh）的细胞群体（各占总细胞的10%）；提取基因组DNA，扩增sgRNA表达盒并进行下一代测序（NGS），对比分选群体与未分选对照的sgRNA丰度差异，鉴定调控基因（图1c）。

二、结果解读

1.全基因组CRISPR文库筛选鉴定IL-1β调控因子

CRISPR文库筛选成功鉴定出295个IL-1β调控基因，其中128个为正向调控因子（敲除后IL-1β降低），167个为负向调控因子（敲除后IL-1β升高），涵盖TLR4、JAK-STAT、EGF等多个已知炎症相关通路，证实筛选体系的有效性（图1）。

图1.人单核细胞系U937中IL-1β调节因子的CRISPR敲除筛选

2.阵列式验证确认筛选结果并区分表达与分泌调控

为验证高通量筛选获得的候选基因，明确其对IL-1β产生和分泌的调控作用，研究者从筛选结果中选取18个正向调控候选基因和18个负向调控候选基因，构建阵列化sgRNA慢病毒库（每个基因2-3条sgRNA），分别转导U937-Cas9细胞，经筛选后诱导分化并LPS刺激，通过流式细胞术检测胞内IL-1β水平，采用MSD免疫分析技术检测上清IL-1β。

结论：

阵列化验证确认了所有18个正向调控基因的功能，其敲除后均显著降低胞内和分泌型IL-1β水平；12个负向调控基因敲除后胞内IL-1β升高，但其中13个基因敲除后分泌型IL-1β减少，提示这类基因可能参与IL-1β的分泌过程（图2）。

图2. U937-LC3-Cas9+细胞中IL-1β调控因子的列组CRISPR验证

3.筛选基因与免疫介导疾病的遗传关联

为了挖掘筛选获得的IL-1β调控基因与人类免疫疾病的遗传关联，研究者利用Open Targets Genetics数据库，检索295个筛选基因在GWAS中的疾病关联信号，整合Locus-to-Gene（L2G）评分（整合遗传、表观遗传和功能基因组学数据的基因优先级评分）；汇总FinnGen、UK Biobank等数据库中28种免疫介导疾病的GWAS数据，筛选与候选基因存在显著关联的疾病；重点分析TENT4A等基因与多发性硬化症（MS）的关联，结合eQTL数据探讨风险SNP对基因表达的影响。

结论：

295个筛选基因中，57个（19%）位于免疫介导疾病的GWAS关联位点，其中28个基因的L2G评分超过0.5（高置信度）；部分基因（如SH2B3、TNFAIP3）与多种疾病存在关联，TENT4A基因的rs34681760 SNP与MS风险相关，且该SNP为TENT4A的eQTL，风险等位基因可上调其在单核细胞中的表达（图3）。

图3. CRISPR筛选与免疫介导疾病的遗传关联

4.TNRC18基因座的遗传多效性与表达调控

筛选出的关键基因与多种疾病的强烈遗传关联且表征性较差，研究者检索FinnGe

n数据库，分析TNRC18基因座的SNP rs748670681与多种免疫疾病的关联，计算等位基因频率和效应值（OR）；构建含rs748670681风险等位基因（T）和非风险等位基因（C）的luciferase报告载体，转染Jurkat和Caco-2细胞，检测转录活性；利用CRISPR-HDR技术构建rs748670681纯合（TT/CC）的U937细胞系，通过RNA-seq检测TNRC18及邻近基因的表达变化。

结论：

rs748670681是芬兰人群中富集的低频率SNP，对多种免疫疾病具有遗传多效性——风险等位基因T可增加炎症性肠病（IBD）、强直性脊柱炎（AS）等疾病风险，同时降低格雷夫斯病、MS等疾病风险；该SNP位于TNRC18的内含子区域，风险等位基因T可显著降低TNRC18和邻近基因WIPI2的表达（图4、图5）。

图4.IBD中TNRC18基因位点的区域关联图

图5. rs748670681变异影响TNRC18和WIPI2基因的转录

5. TNRC18与WIPI2调控截然不同的转录程序目的

为了阐明TNRC18和WIPI2在基因调控中的各自作用，研究者构建TNRC18和WIPI2敲除的U937细胞系，通过TIDE assay验证敲除效率；诱导分化后LPS刺激，RNA-seq分析转录组变化，对比敲除细胞与rs748670681 TT纯合细胞的差异表达基因重叠情况；检测敲除细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子的分泌水平，明确其对炎症因子生产的影响。

结论：

TNRC18和WIPI2调控不同的基因网络：TNRC18敲除可显著降低LPS诱导的IL-1β、IL-6、TNF-α分泌，其下调的基因与rs748670681 TT细胞中下调的炎症基因高度重叠；WIPI2敲除则主要增强干扰素应答基因的表达，与rs748670681TT细胞中上调的基因重叠（图6）。

图6. rs748670681的风险等位基因T改变TNRC18和全局表达特征

6.TNRC18通过调控H3K27乙酰化水平影响炎症基因表达目的

为了揭示TNRC18蛋白调控基因表达的分子机制，研究者整合BioGRID数据库和已发表的BioID实验数据，构建TNRC18的蛋白质相互作用网络，分析互作蛋白的功能富集；对WT和TNRC18敲除的U937细胞进行LPS刺激（0h和16h），通过CUT&Tag技术检测H3K27ac修饰的全基因组分布；分析H3K27ac差异峰的模式富集情况，关联差异峰附近的炎症相关基因，检测关键基因（如CCL24、CCL4）的H3K27ac修饰水平和mRNA表达变化。

结论：

TNRC18通过与染色质重塑相关蛋白（如HDAC3、NCOR1）相互作用，调控炎症基因区域的H3K27ac修饰：TNRC18敲除后，6313个区域的H3K27ac水平降低，2119个区域的H3K27ac水平升高；降低的H3K27ac峰富集于AP1、PU.1等炎症相关转录因子的结合基序，且主要位于LPS诱导的炎症基因（如CCL24、CCL4）的调控区域，导致这些基因的转录激活受阻（图7）。

图7.TNRC18复合物调节H3K27在调节炎症区域的乙酰化

参考文献：Rahimov F, Ghosh S, Petiwala S, et al. A genome-wide CRISPR screen identifies the TNRC18 gene locus as a regulator of inflammatory signaling[J]. Nature Communications, 2025, 16(1): 10346.

技术服务:CRISPR/Cas9细胞基因编辑、CRISPR文库筛选/文库病毒/载体构建、分子诊断参考品/突变基因参考品/融合基因参考品、细胞稳转 / 细胞干扰

细胞试剂:HyCyte®干细胞/原代细胞/细胞株、三系诱导培养试剂、细胞专用培养基、基因编辑试剂盒、病毒现货、预筛选胎牛血清