1. 首先使用野生型小鼠来寻找左心室与脑连接的区域

1.动物模型准备：

使用野生型（WT）小鼠。

2.病毒工具：

使用逆行型腺相关病毒（AAV2/retro-CAG-TdTomato）作为示踪工具，具备逆行追踪能力，可被神经末梢摄取并向上传输至胞体。

3.注射方式：

利用无创超声引导技术，将病毒精确注射至小鼠的左心室（LV）壁，以确保病毒传入心脏神经末梢处。

4.病毒逆行追踪：

病毒在心脏神经末梢被摄取后，逆行运输至神经元胞体，追踪心脏—中枢神经系统的投射路径。

5.组织取材与成像分析：

解剖并分析以下区域：

结节神经节（nodose ganglion）：

可见逆行标记的神经元胞体（表达TdTomato）。它是迷走神经的第一感觉中继站。

其神经元将外周器官的感觉信号（如心脏压力、血管扩张、肠道牵张）传入脑干中的孤束核（NTS）。是联系自主神经系统与外周内脏的关键桥梁。

脑干孤束核（NTS）及极后区（AP）：

发现有 TdTomato 表达的神经纤维，提示结节神经元将LV连接至这些大脑区域。

“WT是地图，疾病是干扰”——要先用WT画清楚基础神经通路地图，再用疾病模型叠加上去看哪些区域出现病理性过度激活，这样结果才更可信、机制才更清晰。

术后1天就测Fos
为了研究整合迷走神经传入神经的神经元的功能相关性，我们分析了 FOS 表达——神经元激活的强大标志物——在接受 TAC 1 天的小鼠背侧迷走神经复合体中，并伴有假对照

2. 建立心-脑-脾神经反射模型：

① 动物模型：野生型（WT）小鼠。脑-脾   TAC → 激活迷走神经传入 → 脑干（NTS）整合 → 输出迷走神经信号 →→ 作用于腹腔神经节 → 激活脾交感神经 → SSNA升高

模型操作：

TAC（主动脉缩窄术）→ 建立左心室（LV）压力超负荷。

假手术为对照组。

② 记录神经活动：

神经放电记录：

测量术后1天的：

腹腔迷走神经活动（CVNA）

脾交感神经活动（SSNA）

比较 TAC 与假手术小鼠。

干预验证：

乳糜泻迷走神经切断术（subdiaphragmatic vagotomy）：

检测其是否可抑制TAC诱导的SSNA升高 → 证明该通路依赖迷走神经。

③ 干预远端交感通路以验证功能： 做下游或者说是远端

腹腔神经节切除（CGX）：

切除脾脏的交感神经输入来源，验证脾神经是否参与心脏重塑。

检测：

脾酪氨酸羟化酶（TH）表达减少（去神经效果验证）-脾脏对神经的反应指标

心脏巨噬细胞数目（流式）

心脏重塑程度（超声EF、RWT等）

时效性验证：

在TAC后第二周再行 CGX（适应性重塑已发生）→ 发现此时 CGX 无法逆转心脏重塑，说明其作用仅在早期阶段关键。

四、验证局部交感神经对心脏重塑的作用：

颈上神经节切除（CerGX）：

去除心脏局部交感神经输入。

检测：

LV交感神经标记缺失（TH染色）

心脏巨噬细胞数量和心脏重塑变化（无明显影响）。

五、排除血流动力学干扰因素：

测量血流动力学参数（超声和多普勒）：

验证 CGX 和 CerGX 不影响 TAC 后产生的压力梯度，排除影响心脏负荷程度的可能。

✅1. 脑到脾脏：走副交感迷走神经

迷走神经（Vagus Nerve）是副交感神经系统的主要组成部分，它：

从脑干出发，延伸至胸腹腔；

支配脾脏、肠道、肝脏等内脏；

在脑-脾通路中，迷走神经控制的是**“反炎性通路”**（例如释放乙酰胆碱，抑制脾巨噬细胞释放TNF-α等炎症因子）。

🧠➡️（迷走神经）➡️ 脾脏

即：“炎症调控指令”来自脑部，通过迷走神经传入脾脏。

✅2. 脾脏到心脏：走交感神经

交感神经系统控制“应激”或“战斗-逃跑”反应：

交感神经来自脊髓→交感链→目标器官；

脾脏的交感神经主要来自腹腔神经节（celiac ganglion）；

心脏的交感神经则来自颈上交感神经节（e.g., superior cervical ganglion）。3.  建立心-脑-脾神经反射模型：

3. 脾脏切除证明脾脏对TAC小鼠心脏功能及巨噬细胞扩张是有促进作用的

4. 明确脾脏作用于心脏的方式和分子-确定是脾脏通过分泌蛋白发挥的心脏巨噬细胞增殖调控作用

心脏巨噬细胞的扩增障碍是由于脾脏对心脏输送的免疫细胞减少还是由于对心脏巨噬细胞的分泌调控作用？

所以后面作者使用了两种基因鼠，包括用Nr4a1−/− 和 Ccr2−/− 小鼠。排除了Ly6Chi单核细胞来源的促炎通路参与巨噬细胞扩张，推测脾脏是通过旁分泌方式（而非动员单核细胞）介导心脏巨噬细胞扩张的。然后作者猜想是否是原位巨噬细胞RM（Timd4⁺、Ly6C⁻）是否在心脏应激下通过自身扩增来支持心脏的适应性？使用的是原位巨噬细胞敲除的小鼠。后面又用了Timd4⁺Lyve1⁺Ly6C⁻作为心脏 RM 的代表来具体检测是否影响了心脏原位巨噬细胞的增殖。压力超负荷（TAC）会驱动心脏 RM 的局部增殖，而不仅仅依赖单核细胞募集，从而支持心脏对血流动力学负荷的适应性重塑。

心脏应激（TAC）→ 正常情况下 RM（Cx3cr1⁺）增殖 → 促进适应性心肌肥厚 → 阻止 LV 扩张和 HF

但在 Cx3cr1−/− 小鼠中，RM 无法扩增 → 适应失败 → 快速发展为 HF

✅ 为什么心脏巨噬细胞扩张失败会导致心力衰竭？

在压力超负荷（如TAC）早期，心脏需要适应性重塑来应对不断增强的机械应力。如果在这一阶段：

巨噬细胞不能扩张，或扩张的巨噬细胞功能异常，

就会导致：心肌细胞应激无法被缓解，毛细血管重构失败，炎症清除延迟，纤维化反应紊乱，最终导致适应性重塑向病理性重塑转变，进展为心力衰竭。研究发现，这一阶段扩张的巨噬细胞主要是抗炎、修复型巨噬细胞，它们通过以下方式发挥保护作用：清除死亡细胞（胞葬）分泌抗炎因子如IL-10、TGF-β促进成纤维细胞和血管细胞有序激活调控心肌细胞代谢与应激反应。

🧾已有文献和前期工作提示：

PlGF在其他高血压模型中（如Ang II刺激）已经被发现与心血管重塑相关。

作者自己曾报道过Pgf⁻/⁻小鼠对压力超负荷表现出不良重塑（reference 14），这是一个强有力的前提线索。

另有研究表明交感神经通路能促进脾脏分泌PlGF（reference 24），提示PlGF可能是脾脏介导心脏-免疫对话的关键信号分子。

1. 观察现象（前期基础）

Pgf⁻/⁻小鼠在 TAC 后表现为心脏不良重塑 → 说明 PlGF 可能是正向调控因子。

2. 分析 TAC 后 PlGF 的动态表达

TAC 会诱导脾脏中 PlGF 表达迅速上升，1 周后恢复基线；

血浆中 PlGF 水平也随之升高 → 表明 PlGF 在系统水平被释放，可能影响远处器官如心脏。

3. 分析 PlGF 缺失对心脏免疫反应的影响

Pgf⁻/⁻小鼠在 TAC 后无法扩增心脏巨噬细胞（特别是 Timd4⁻Ly6C^low resident macrophages, RM）；

且这些 RM 的增殖能力也显著受损→ 提示 PlGF 是其扩增的关键因子。

4. 明确 PlGF 来源于脾脏

组织学显示 PlGF 在 TAC 后位于ERTR7⁺网状细胞界定的脾脏边缘区；

该区由 TH⁺交感神经纤维支配 → 暗示神经-免疫调控机制。

5. 验证交感神经依赖性

交感去神经（CGX）后小鼠：

脾脏 PlGF 表达不再上升；

循环 PlGF 水平也无升高；

心脏 RM 不再增殖；

→ 证实交感神经控制脾 PlGF 分泌，进而影响心脏免疫状态。

6. 功能性验证：脾移植模型

将PlGF 缺失脾脏移植至 WT 小鼠→ 无法改善 TAC 诱导的心功能障碍；

将WT 脾脏移植至 PlGF 缺失小鼠→ 心功能恢复；→ 说明PlGF 的脾源性是介导适应性重塑的关键。

7. 替代补救验证：rPlGF 治疗

TAC + 脾切除的小鼠 → 会发展为 HF；

注射重组 PlGF（rPlGF） → 可拯救其心功能，增强 RM 增殖；→ 证明PlGF 作为远端细胞因子作用于心脏，具有功能可替代性

5. 单细胞数据验证心脏中确实是原位的巨噬细胞表达最多的PlGF受体

6. 受体敲除 Nrp1-floxed （Nrp1FL/FL） 与 Lyz2-cre 小鼠

7.压力超负荷 ➜ 脾源PlGF分泌 ➜ 激活NRP1⁺ RM ➜ 分泌IGF-1 ➜ 心肌适应性重塑-找到具体分泌的东西是什么

8. NRP1⁺ RM扩增（分化为增殖型RM / IGF-1⁺ RM / CD206⁺纤维化RM）-也确定了另一个表型即胶原沉积的巨噬细胞类型