鲲羽科普| IF-FISH“双剑合璧”：一张图上同时呈现蛋白和基因

荧光原位杂交（FISH）和免疫荧光（IF），是分子生物学相关专业的小伙伴们都耳熟能详的两种技术，它们各司其职：FISH用于定位核酸，IF则擅长捕捉蛋白质。而当我们将二者结合——IF-FISH双染，便能在细胞的同一张“原位”蓝图上，窥见蛋白质与核酸之间的精彩对话，同时、同位地捕获基因转录的“中间指令”（RNA）与蛋白功能的“最终执行”（蛋白）。今天我们就一同探讨IF-FISH双染实验的常见应用场景，如何优化实验流程，以获得更好的结果。

01背景概述

荧光原位杂交（FISH）：核心是核酸碱基互补配对的原则，利用荧光标记的单链核酸探针，与待检材料中特定的DNA或RNA进行杂交，从而在原位水平显示基因的存在、拷贝数与转录活性。

免疫荧光（IF）：基于抗原抗体的特异性结合，通过带有荧光标记的抗体，与细胞或组织内的相应抗原进行免疫结合，从而直观地呈现蛋白质分布及表达，揭示细胞的功能状态。

IF-FISH的结合，可以实现从“单维度观测”到“多维度关联”的跨越。将RNA和蛋白质在原位关联起来，让我们能在一张图上直接回答：特定基因活动是否驱动了相应的蛋白功能？这为精准解析生命机制提供了不可替代的时空动态验证。

02 IF-FISH应用场景

IF-FISH双染实验，在真实的科研与临床上究竟如何大显身手？实际上，根据探索目标不同，IF-FISH的应用主要围绕“DNA”和“RNA”两大遗传核心，结合蛋白功能，分别在基础科研和临床医疗检测领域中展现其独特价值。

·基础科研领域

在基础科研领域，IF-FISH双染（以RNA-FISH为主）的核心在于探索RNA与蛋白的动态关系，主要应用场景包括：

1）非编码RNA与蛋白的互作：通过验证RNA与蛋白的空间互作来进行功能与机制相关探索；

2）病原体-宿主互作方向：研究者常以IF标记宿主免疫细胞标志物、炎性因子、病毒蛋白，用FISH定位病毒核酸，以此精确揭示病毒与宿主感染细胞的空间关系、宿主-病原体相互作用、免疫应答机制等；

3）局部翻译与mRNA运输方向：通过IF标记突触标志物或核糖体，同时用FISH靶向与突触可塑性特定mRNA，便可验证mRNA是否被精准运输到神经突触等特定区域并进行局部翻译，这对于理解突触可塑性等过程至关重要。

案例一：2015年Nature报道的加州理工学院团队通过标记Xist RNA，其结合蛋白（如SHARP）以及RNA聚合酶II（Pol II）等关键因子，揭示该RNA通过招募蛋白来排斥RNA聚合酶II，从而实现X染色体转录沉默的关键机制（图1）。

图1：SHARP是将Pol II排除在Xist涂层区域之外所必需的（来源： Mitchen Guttman, et al. Nature, 2015.）

案例二：美国宾夕法尼亚大学John B Hogenesch团队则通过观测到LncRNA-NROR 和核心生物钟蛋白PER2在核周的共定位，并结合基因敲降实验，证实了NROR通过抑制PER2蛋白的磷酸化与核易位来调控昼夜节律（图2）。

图2 PER/CRY复合物与NRON复合物的生化相互作用和共定位（来源：Yool Lee et, al. Scientific Reports,2019）

·临床检测领域

在临床医疗检测领域，IF-FISH（以DNA-FISH为主）通过患者组织或血液/体液等样本的多维度分析，为肿瘤管理等提供关键的诊断信息。其主要应用场景包括：

1）循环肿瘤细胞分型与动态检测：对血液中脱落的细胞型循环肿瘤生物标志物-循环肿瘤细胞（CTC）和肿瘤血管内皮细胞 (CTEC)进行IF-FISH共染，可同时从基因扩增/染色体异常（FISH）、瘤标蛋白标志物表达（IF）和细胞形态三个维度实现精准分型和耐药性评估。该方式便于在治疗过程中多次取样，动态监测疗效与病情演变。

图3 TC与CTC（图源网络）

2）免疫治疗与用药指导：利用IF-FISH同时检测患者肿瘤细胞的关键基因突变状态和瘤标蛋白的表达水平，能够对肿瘤精准分型，直接指导靶向药物选择，并实时监测治疗过程中可能出现的耐药情况。

3）肿瘤手术切缘精准评估：传统病理检测无法识别“区域性癌变细胞”（形态正常但遗传学染色体异常）。IF-FISH通过综合分析染色体数目、瘤标蛋白及细胞形态，能够精准定位这些潜在风险区域，为肿瘤精准诊疗确定最佳手术切缘位置，降低复发风险提供有力依据。

03 IF-FISH实验难点与应对方法

前面主要介绍了IF-FISH“双剑合璧”的应用场景，那在实际操作过程中我们又容易遇到哪些难点？

IF-FISH作为一项复合实验，其挑战主要在：难以平衡样本通透性与RNA和蛋白靶标完整性；操作流程冗长且缺乏有效中间质控；实验条件需根据样本情况高度个性化调整。针对这些难点，可参考以下策略：

1. 优化样本前处理，兼顾通透与靶标保存

传统FISH依赖蛋白酶实现通透，但易破坏蛋白靶标。在IF-FISH中，建议选择使用较温和的去垢剂（如TritonX-100、Tween-20、NP40等）配合无水乙醇或高温煮片诱导抗原修复等操作，在最大限度保存蛋白靶标的前提下适度增强细胞膜通透性，以利于探针渗透。

    2. 设置系统对照，实现全过程质控

由于实验周期长且无法中途检测，严谨的对照设置至关重要。建议设置包括以下四组平行对照：

FISH单标阳性对照：验证探针有效性及RNA检测操作

IF单标阳性对照：确认抗体特异性及蛋白检测操作

RNA阴性对照（如细菌dapb探针）：鉴别非特异性吸附或自发荧光

蛋白阴性对照（如IgG）：评估抗体非特异结合及背景荧光

所有对照应与实验组RNA-蛋白共标同步进行样本相同前处理，以系统性排除操作误差。

   3. 开展预实验，建立样本特定前处理条件

不同样本类型对前处理的要求差别很大。在正式IF-FISH实验之前，建议先分别进行FISH与IF单标实验，并独立优化各自前处理条件，再逐步整合并调整兼容性，最终确定共标体系的最佳前处理条件，再进行IF-FISH共标实验，确保RNA与蛋白信号的精准检出。

IF-FISH技术完美融合了蛋白定位与基因检测，成功打破了以往“功能”与“基因”在细胞研究中相互割裂的壁垒。尽管技术门槛较高，但通过优化通透方法、设立严谨对照和充分预实验，我们完全有能力掌握这一强大工具。技术的整合将有效推动生命机理探索到临床精准医疗的跨越发展。

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参考文献：

McHugh, C., Chen, CK., Chow, A. et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature 521, 232–236 (2015).

Gao Y, Zhu Y, Zhang Z, Zhang C, Huang X, Yuan Z. Clinical significance of pancreatic circulating tumor cells using combined negative enrichment and immunostaining-fluorescence in situ hybridization. J Exp Clin Cancer Res. 2016;35:66. 

Lee, Y., Shen, Y., Francey, L.J. et al. The NRON complex controls circadian clock function through regulated PER and CRY nuclear translocation. Sci Rep 9, 11883 (2019).

Zimmerman, S., Peters, N., Altaras, A. et al. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nat Protoc 8, 2158–2179 (2013).