N6‑甲基腺苷（m6A）是mRNA和非编码RNA中的一种修饰核苷酸，它主要通过促进特定转录本的降解来影响基因表达。近期研究强调了这种RNA修饰在癌症中动态且依赖于特定环境的作用，并指出其与肿瘤发生、免疫逃逸和治疗耐药密切相关。本文综述了m6A的写入酶、擦除酶和读取酶在癌症中的功能。我们重点阐述了m6A失调如何促进肿瘤发生过程，包括细胞分化和免疫微环境重塑。以血液系统恶性肿瘤为例，我们强调了m6A依赖性调控的原理，这些原理可能广泛适用于多种癌症类型。值得注意的是，靶向m6A写入酶甲基转移酶样蛋白3（METTL3）的抑制剂已成为潜在的癌症治疗药物。METTL3抑制剂不仅能破坏m6A依赖性通路，还能提高双链RNA水平，从而激活先天免疫反应和抗肿瘤免疫。我们强调，在癌症和机制研究中需要高分辨率定量m6A图谱，以便更好地了解癌症中m6A模式改

变的特定转录本，并确定最有可能从METTL3抑制剂中受益的患者亚组。

N6‑甲基腺苷（m6A）是mRNA和长链非编码RNA中最丰富的修饰核苷酸。它于20世纪70年代被发现是mRNA的组成部分。在拟南芥的一项研究表明，哺乳动物m6A甲基转移酶样蛋白3 (METTL3) 的植物同源物缺失会导致发育缺陷。之后，人们对m6A的功能作用产生了浓厚的兴趣。这项研究首次揭示了m6A在多细胞生物中的作用，并阐明了其在发育中的重要性。随后，首个全转录组m6A定位测序方法的开发揭示了哺乳动物转录组中高度选择性的甲基化模式，表明m6A可能影响特定的mRNAs和细胞过程。

m6A 修饰途径涉及写入酶、擦除酶和读取酶（图1）。METTL3与METTL14形成复合物，利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，将RNA中的腺苷甲基化形成m6A。除了主要的m6A写入酶METTL3外，METTL16也作为少数转录本的m6A写入酶（框 1）。擦除酶，例如alkB同源物5 (ALKBH5)和脂肪量与肥胖相关蛋白(FTO)，可以以 α-酮戊二酸 (α-KG) 依赖的方式，在特定位点去除m6A甲基。读取蛋白包括含有YTH结构域的蛋白YTHDC1（一种核蛋白）以及含有YTH 结构域的家族蛋白YTHDF1、YTHDF2 和YTHDF3（三种几乎相同的旁系同源蛋白，主要存在于胞质中）。m6A读取蛋白主要通过结合m6A来调控 RNA 稳定性，但它们也能影响其他过程，例如翻译或剪接。核内m6A读取蛋白YTHDC1被鉴定为剪接调节因子transform-2蛋白同源物β (TRA2B) 的相互作用蛋白，并已被证实能够影响前体mRNA的剪接和核输出。此外，YTHDC1还能形成核凝聚体（nuclear condensates），保护核内RNA免受降解。相比之下，胞质YTHDF读取蛋白主要促进RNA降解，这凸显了m6A读取蛋白在RNA调控中具有区室特异性作用。除了直接结合m6A的含YTH结构域的蛋白外，还有其他一些蛋白被认为能够与m6A相互作用，但它们在体内与m6A的结合方式及其功能仍未完全阐明。m6A修饰可以影响RNA的二级结构，通常会使其线性化，从而增加RNA结合蛋白的可及性。这些蛋白的例子包括RNA结合基序蛋白、X染色体（RBMX）、异质核糖核蛋白C1/C2（HNRNPC）、HNRNPA2B1和胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白（IGF2BP）。然而，m6A诱导的RNA线性化的生理意义尚不清楚。

图 1 | m6A程序及受m6A控制的主要癌症相关过程N6-甲基腺苷 (m6A) 由多蛋白写入复合物在转录过程中共沉积。甲基转移酶样蛋白3 (METTL3) 和 METTL14构成其催化核心。写入复合物的其他组分包括RNA结合基序蛋白15 (RBM15)、前体mRNA剪接调节因子WTAP、蛋白virilizer同源物 (VIRMA)、含锌指CCCH结构域的蛋白13 (ZC3H13) 以及E3泛素连接酶HAKAI，其在写入复合物中的功能至关重要，但尚未完全阐明。S-腺苷甲硫氨酸是METTL3的结合辅因子，提供甲基用于甲基化（图中未显示）。结合在外显子边界的外显子连接复合物 (EJCs) 起到物理屏障的作用，阻止编码序列中这些区域发生甲基化，而EJC缺失的区域，例如长的内部外显子和3′非翻译区，则更容易发生甲基化。因此，EJC通过调节mRNA区域对写入复合物的可及性来影响m6A的沉积。这表明剪接模式可能影响m6A标记的沉积位置，尤其是在外显子-外显子连接周围的区域。核内读取蛋白YTH结构域蛋白1 (YTHDC1) 结合m6A修饰的RNA，从而影响剪接、转录和核输出，并与m6A标记的RNA（例如MALAT1）形成凝聚体。YTHDC1与核外泌体靶向复合物（NEXT复合物）相互作用，该复合物在核RNA降解中起关键作用。一部分m6A标记的染色质相关RNA（主要是LINE1重复序列）通过NEXT复合物被YTHDC1去稳定。相反，YTHDC1通过保护m6A标记的mRNA靶标（包括MYC和GINS2）免受poly(A)尾外泌体靶向复合物（PAXT复合物）介导的降解，从而稳定这些靶标。YTHDC1的缺失会影响许多核RNA加工过程，包括剪接、核输出、多聚腺苷酸化位点选择、核RNA降解和表观遗传调控。m6A可被去甲基化酶去除，例如alkB同源物5 (ALKBH5) 和脂肪量与肥胖相关蛋白 (FTO)。这些去甲基化酶主要位于细胞核内。FTO是一种高效的去甲基化酶，可去除小核RNA (snRNA) 中的N6,2′-O-二甲基腺苷 (m6Am)，并且已被证实能够去除m6A，尤其是在逆转录转座子RNA中。在细胞质中，含有YTH结构域的家族蛋白YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3可识别m6A，其主要功能是通过募集CCR4-NOT去腺苷酸化酶复合物来促进mRNA降解。在某些情况下，m6A可能通过与胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白 (IGF2BP) 结合来稳定mRNA，并且发现少数m6A位点能够与IGF2BPs结合。其他RNA结合蛋白 (RBPs)，包括异质核糖核蛋白C1/C2 (HNRNPC) 和X染色体RNA结合基序蛋白 (RBMX)，由于m6A诱导的RNA二级结构变化而与m6A修饰的转录本结合。它们的结合会影响靶RNA的剪接、稳定性和翻译。研究表明，m6A写入酶、读取酶和擦除酶的改变共同调节肿瘤细胞以及肿瘤微环境中的癌症相关过程。RNA Pol II，RNA聚合酶II。

框1 | METTL16与癌症

除了甲基转移酶样蛋白3 (METTL3)–METTL14写入复合物外，METTL16也被发现是一种N6-甲基腺苷(m6A)写入酶。然而，与METTL3相比，METTL16表现出高度选择性的靶标特异性。METTL3的缺失会导致poly(A) RNA中m6A几乎完全丢失（约99%），而剩余的m6A被认为是由METTL16生成的。与多蛋白m6A写入复合物不同，METTL16作为一种单组分酶发挥作用，其底物特异性由独特的RNA二级结构中的5′-UACAGAGAA-3′共有序列决定。METTL16最确定的mRNA靶标是甲硫氨酸腺苷转移酶2A (MAT2A)，该酶编码合成S-腺苷甲硫氨酸的酶，S-腺苷甲硫氨酸是一种酶辅因子，可作为多种甲基化事件的甲基供体。METTL16还合成U6小核RNA中的m6A，m6A对剪接至关重要。METTL16对正常细胞和恶性细胞的存活都至关重要。急性髓系白血病中METTL16表达升高，这可能促进白血病干细胞的自我更新，凸显了其致癌作用。METTL16可能具有非催化功能，尤其是在肝癌和肺癌中，据报道它能促进翻译起始复合物的组装并促进翻译。

m6A最明确的功能是通过m6A识别蛋白YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3促进胞质RNA降解。m6A诱导的mRNA降解始于mRNA的翻译。由于m6A修饰会阻碍转运RNA（tRNA）有效进入核糖体，核糖体会在m6A位点停滞。停滞或碰撞的核糖体似乎会募集YTHDF蛋白以促进其与m6A的结合，从而导致mRNA降解。该过程也可受tRNA调控。tRNA含有多种修饰，其中一种修饰5‑甲基羧甲基‑2‑硫尿苷（mcm5s2U）有助于核糖体避免在m6A位点停滞。在肺癌、结直肠癌和血液癌症中，mcm5s2UtRNA修饰的上调减少了致癌转录本的m6A介导的衰变，可能促进癌症进展。

然而，在某些情况下，例如MYC mRNA，m6A可能导致mRNA不稳定、稳定或完全没有影响，这取决于检测MYC的特定细胞类型。m6A在MYC中的这些不同结果可能是由于其他RNA结合蛋白与MYC 5′和3′非翻译区 (UTR) 相互作用，从而导致这些依赖于情景的影响。

当m6A存在于同一mRNA的多个位点时，其影响尤为显著。这些高度甲基化的转录本稳定性较差，且在细胞中的表达水平通常较低。除了m6A位点的数量外，还需要考虑其化学计量比，即基因中特定位点含有m6A的转录本比例。值得注意的是，位于对应于长内部外显子（long internal exons）区域的mRNA中的m6A位点通常具有较高的化学计量比，并且与高效的mRNA降解相关。相比之下，位于3′ UTR远端区域或外显子‑外显子连接附近的m6A位点具有较低的化学计量比，且与mRNA降解的相关性较弱。

m6A通路失调与多种疾病相关，尤其是癌症。在癌症中，m6A模式的改变会扰乱基因表达并促进肿瘤进展。本文将探讨目前对m6A修饰如何影响癌症的认识。我们首先概述了m6A失调在癌症中的程度、机制和临床意义，重点强调其在肿瘤促进和肿瘤抑制中的双重作用。接下来，我们探讨了m6A如何调控癌症相关通路和过程，包括表观遗传调控和先天免疫反应（图1）。最后，借鉴METTL3抑制剂的研发经验，我们重点阐述了m6A调控过程的治疗意义，并提出了推进m6A靶向癌症疗法未来发展所需的步骤。

癌症中m6A的失调

m6A RNA甲基化在癌症中经常发生异常调控，其甲基化模式在不同类型的肿瘤之间，甚至在同一分子亚型内部也存在差异。这些改变可能源于多种机制，包括m6A甲基化机制的遗传、转录、代谢和空间调控，这些机制共同塑造了癌症转录组并影响疾病进展。

RNA中m6A定位的方法

癌症生物学中对m6A的兴趣日益浓厚，这源于一些研究检测到了肿瘤环境中m6A的改变模式。这些研究得益于最初的定位技术，即甲基化RNA免疫沉淀测序 (meRIP-seq) 和一种本质上相同的独立开发的方法，即m6A-sequencing。这些方法利用抗m6A抗体对含有m6A的RNA片段进行免疫沉淀和测序。测序结果可以比对形成称为“m6A peaks”的簇，这些簇是mRNA中含有m6A修饰的约100‑200个核苷酸的区域。这些初步的定位方法在约6000个mRNA中发现了约13,000个m6A位点。早期对癌症生物学的应用集中于A549人类肺癌细胞，在5,099个基因中鉴定出9,298个m6A峰。这项研究和其他研究表明，m6A在癌症中的分布可能与正常组织中的分布不同。

自发现以来，m6A定位工具取得了长足的进步，实现了单核苷酸分辨率和定量精度。m6A单核苷酸分辨率交联和免疫沉(miCLIP)方法通过将m6A抗体交联到RNA上并定位精确的交联位点，首次实现了转录组中m6A位点的核苷酸分辨率定位。然而，m6A并非简单的“开‑关”二元修饰，而是在不同转录本中呈现动态的化学计量比。早期的位点特异性mRNA标记方法，包括SCARLET（位点特异性切割和放射性标记，随后进行连接辅助提取和薄层色谱）和SCARPET（位点特异性切割和放射性标记，随后进行纯化、核酸外切酶消化和薄层色谱），通过对特定位点进行生化检测，揭示了m6A化学计量比的变化，从而支持了这一概念。为了全面分析转录组中每个位点的m6A化学计量比，新型的m6A定位方法开始区分高化学计量比和低化学计量比的m6A位点。一种定量方法是RNA修饰靶点邻近脱氨基法（DART‑seq），该方法涉及表达与载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样（APOBEC）RNA修饰酶融合的m6A结合YTH结构域。这种融合蛋白被募集到m6A位点，并将相邻的胞嘧啶转化为尿嘧啶，从而实现化学计量评估。该方法已应用于多种细胞类型和稀有⼲细胞群，包括造血⼲细胞（HSCs）和小鼠脑区。在这些研究中，DART‑seq鉴定出多种m6A位点的化学计量比，其中大多数位点的化学计量比较低，但部分m6A位点的化学计量比较高，并且富集于与细胞信号传导和代谢相关的通路中。

另一种方法GLORI采用化学方法将所有腺苷转化为肌苷，但保留m6A位点。因此，由于肌苷被读取为鸟苷，可以通过全转录组测序轻松评估化学计量比。GLORI分析进一步表明，致癌转录本（例如MYC）通常含有高化学计量比的m6A位点，在许多情况下，其化学计量比在80%到90%之间。尽管其他⼏种方法已被证明能够以单核苷酸分辨率提供m6A化学计量比的高精度定量测量，包括 MAZTER‑seq、改进的TadA辅助N6‑甲基腺苷测序(eTAM‑seq) 和m6A选择性烯丙基化学标记和测序 (m6A‑SAC-seq)，但GLORI似乎具有最高的定量准确性。

近年来，牛津纳米孔技术的进步为利用直接RNA测序检测m6A化学计量比提供了一种新方法。纳米孔测序能够揭示单个长读长RNA分子中的m6A位点（表1）。纳米孔测序的优势在于其测序文库制备和m6A定量相对简便，且其定量精度与GLORI相当。

表 1 | m6A的定量测量方法

尽管定量m6A定位是一种相对较新的方法，但它在绘制癌症中m6A异常方面具有巨大潜力。目前，缺乏大规模数据集来比较匹配的正常组织和癌组织样本的位点m6A化学计量比，这构成了理解癌症中m6A动态变化的关键空白。许多研究已使用meRIP‑seq比较正常组织和癌组织，并识别出m6A水平降低或升高的潜在位点，但该方法缺乏位点特异性和定量的化学计量比测量，而这些测量可以通过更新的方法实现。确保这些图谱的准确性尤为重要，因为meRIP‑seq已得出广泛结论，即癌症中m6A的改变发生在编码增殖、分化、转移或治疗反应调控因子的mRNA中。这些改变的甲基化事件通常与不同的细胞表型相关，包括肿瘤分期、转移程度和对治疗⼲预的耐药性。因此，用更高分辨率的方法验证这些发现将有助于确定m6A在癌症中的动态和机制。

m6A失调在癌症中的机制

研究发现，m6A通路中的许多组分在癌症中均存在失调，并介导m6A的改变。这些改变包括m6A写入复合物、擦除蛋白和读取蛋白的表达异常。其他机制还包括m6A调节因子的基因改变以及代谢和转录失调。这些改变具有临床意义，因为m6A调节因子的突变或表达失调会影响患者的生存期和治疗反应。

m6A写入复合物表达改变。在多种癌症中均观察到m6A写入复合物一个或多个组分的表达改变。例如，METTL3在血液系统恶性肿瘤和实体瘤（如结直肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和肝癌）中均经常上调。通常，上调程度为1.5倍至3倍。值得注意的是，m6A的丰度与肿瘤分期相关，并且在转移性肿瘤中比邻近的非癌组织高出2‑3倍。与此一致的是，METTL3的高表达通常与不良预后相关，进一步说明了其促肿瘤的潜力。

初步研究寻找METTL3和/或METTL14表达增加的癌症，发现与其他癌症相比，它们在急性髓系白血病 (AML)中上调最为显著。随后的研究集中于了解AML中的m6A。

METTL3表达增加可能不会均匀地影响所有m6A位点，因为许多m6A位点已经以高化学计量比甲基化。因此，METTL3表达升高更有可能选择性地增加原本甲基化程度较低的位点的m6A化学计量比。这提示METTL3在癌症中的过表达可能通过导致m6A出现在通常不含m6A的位点而赋予功能获得性表型。重要的是，这种功能获得性效应无法通过野生型细胞中METTL3的敲低方法来研究，因为这种方法会特异性地靶向通常高度甲基化的位点，而无法捕捉新获得的m6A位点的调控作用。这凸显了采用其他实验策略（例如功能获得性研究或位点特异性诱变）来全面了解癌症中m6A修饰模式的必要性。

值得注意的是，单个m6A修饰组分的上调并不一定会增加整体m6A水平，而且许多研究并未直接评估m6A的化学计量比是否发生改变。事实上，不同的研究报道了不同癌症中m6A水平的升高和降低。此外，尚不清楚每种癌症是否都依赖于这些改变的m6A水平。难点在于m6A广泛存在于各种转录本中，并且影响着众多细胞通路，这使得确定因果关系变得困难（框2）。

框2 | 解读m6A图谱的技术挑战

确定受N6-甲基腺苷 (m6A) 直接调控的mRNA对于理解m6A如何调控细胞功能至关重要。然而，区分受m6A直接影响的mRNA和受m6A依赖性通路影响的mRNA极具挑战性。其中一个原因是含有m6A结合位点的转录本数量众多，这使得人们很容易得出结论：任何受m6A耗竭影响的转录本都是m6A的直接靶标。然而，由于大多数m6A结合位点的化学计量比较低，这些位点不太可能对mRNA产生显著的调控作用。在大多数情况下，研究报告了m6A的癌症特异性变化，并鉴定出仅在正常细胞或癌细胞中定位的m6A结合位点。然而，这些定位研究是在定量m6A定位方法出现之前进行的。他们依赖于早期基于信号峰的方法，这些方法使用固定阈值来确定m6A位点的存在与否。因此，被鉴定为癌症选择性的m6A位点可能仅仅反映了在正常组织中略低于阈值、而在癌症组织中略高于阈值的信号峰。这种差异可能源于测量中的正常变异，尤其是在信号峰高度被认为是噪声的情况下，这会给人以癌症特异性的误导性印象。如果这些差异具有实际意义，则可能反映了m6A化学计量比的微小变化，即该位点含有m6A的转录本的百分比。例如，化学计量比为2%的位点可能变为4%，这可能是一个非常大的倍数变化，并在定位研究中表现为癌症选择性m6A位点。然而，由于m6A的总体化学计量比较低，此类变化可能生物学意义有限，并且不会显著影响整体基因表达。一个主要目标是识别发生显著化学计量比变化的癌症特异性m6A位点。尽管如此，m6A的较小变化也可能具有意义。由于m6A通常以簇状形式存在，低化学计量比位点簇可能提供足够的m6A总量以赋予生物学功能。随着新技术的出现，重新评估癌症转录组至关重要，以确定先前报道的癌症中m6A模式的变化反映的是m6A位点的总体增加或减少、所有m6A位点化学计量比的整体增加或减少，还是位点特异性的化学计量比变化。

m6A消除酶的表达改变。m6A消除酶，例如ALKBH5和FTO，在多种癌症类型中均表现出表达失调。ALKBH5在急性髓系白血病（AML）、胶质母细胞瘤、乳腺癌和胰腺癌中表达上调，而在肝癌、结肠癌、胃癌和膀胱癌中表达通常降低。值得注意的是，ALKBH5似乎对特定位点具有高度选择性，而非非特异性的m6A去甲基化酶。因此，ALKBH5表达的变化可能不会显著影响整体m6A水平，而是会影响特定的转录本和通路。

FTO表达的改变也具有情境依赖性，在急性髓系白血病（AML）、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌和肺癌中均有报道其表达增加，而在肝癌、甲状腺癌、卵巢癌和肾细胞癌中则有报道其表达降低。尽管FTO最广为人知的功能是其去甲基化m6A，但最近一项研究采用Oxford纳米孔直接RNA测序方法定量了对照组和FTO敲低的AML细胞系中m6A的精确化学计量比。在未经同行评审的预印本中，该研究小组报告称，FTO敲低对任何可检测到的mRNA位点的m6A均无影响。值得注意的是，FTO敲低并未影响MYCmRNA中任何m6A位点的化学计量比，而MYC mRNA通常被认为是FTO的靶点。尽管这些结果需要进一步验证，但它们挑战了FTO依赖性调控m6A在癌症中的作用这一概念。值得注意的是，除了其作为m6A去甲基酶的广泛研究之外，生物化学研究还表明，FTO对N6, 2′-O-二甲基腺苷（m6Am）的去甲基化效率更高，m6Am是m6A的一种相关修饰。m6Am选择性地位于mRNA和小核RNA的7-甲基鸟苷帽结构相邻的第一个核苷酸位置。四环素甲基胞嘧啶双加氧酶2(TET2) mRNA上的m6Am修饰已被证实能增强其翻译效率，而催化m6Am沉积的m6Am甲基转移酶PCIF1-C端结合蛋白2 (CTBP2)复合物与促进头颈部鳞状细胞癌的致癌程序有关。大多数研究FTO在癌症中作用的研究并未区分其作用源于m6A还是m6Am的变化，因为区分这两种修饰在技术上仍然具有挑战性。平行实验结合FTO耗竭（可增加m6A和m6Am）以及METTL3或PCIF1耗竭（可选择性地降低m6A或m6Am），可以阐明FTO的作用是通过其中一种还是另一种介导的。

m6A阅读器的表达发生改变。最近一项泛癌分析检测了癌症基因组图谱（TCGA）数据库中31种肿瘤类型近10,000个样本中的16个m6A核心因子，揭示了显著的跨肿瘤模式。其中，VIRMA、YTHDF1和YTHDF3是癌症中最常扩增和过表达的基因，而YTHDF2则经常下调。与未上调的肿瘤样本相比，VIRMA、YTHDF1和YTHDF3的上调与更差的预后相关，而YTHDF2下调则预示着更好的预后。这些因素也表现出对无进展生存期具有一致的泛癌预测能力。相比之下，与其他m6A相关因子相比，METTL3在肿瘤中高表达的频率明显较低，并且缺乏对患者生存期的预测能力，尽管之前的报道表明METTL3高表达与不良预后相关。

尽管这项泛癌分析提供了关于各种癌症类型中m6A修饰机制常见基因表达改变的概览，但它并未涵盖单个肿瘤类型中存在的全部改变。例如，在急性髓系白血病（AML）中，YTHDF2和YTHDC1过度表达，并在维持白血病⼲细胞活和保护正常造血⼲细胞（HSCs）方面发挥关键作用。同样，YTHDF2高表达与胶质瘤患者预后不良相关，并且在临床前模型中，YTHDF2促进胶质母细胞瘤细胞增殖、侵袭和肿瘤发生。

基因改变。m6A调控因子的表达改变与癌症相关，然而，如上所述，与大多数癌症相关基因不同，m6A调节因子的突变相对罕见。根据TCGA的数据，仅有2%的癌症表现出METTL3基因的遗传改变（包括扩增、突变和缺失）。相比之下，常见肿瘤抑制基因TP53的基因改变在癌症患者中的患病率约为40%。

m6A基因改变的一个显著例子是RNA结合基序蛋白15 (RBM15，也称为OTT1)，它是m6A写入复合物中的关键RNA结合蛋白。造血干细胞(HSCs)中RBM15的缺失会显著降低HSCs的功能，并且其缺失的表型与HSCs中METTL3缺失的许多特征相似。涉及RBM15的一个高度相关的基因改变是染色体易位 t(1;22)，它产生一种与巨核细胞白血病1（MKL1，也称为MAL、BSAC和MRTFA）的融合蛋白，这种融合蛋白最常见于儿童急性巨核细胞白血病 (AMKL)。更具体地说，RBM15的一个4 kb内含子区域（位于编码C端SPOC结构域的外显子下游）与MKL1内的一个内含子融合。由此产生的剪接转录本生成了一个RBM15-MKL1同框融合蛋白，该融合蛋白包含两个基因的几乎全长编码序列，从而产生一个含有1,833个氨基酸的嵌合蛋白。

尽管RBM15‑MKL1驱动急性髓系白血病（AMKL）的确切机制尚不清楚，但其保留了RBM15和MKL1的功能域，提示其可能通过保留的功能和新功能参与白血病发生。RBM15调控造血⼲细胞（HSCs）的命运，并对谱系分化（包括髓系和巨核系分化）发挥抑制作用，这可能有助于RBM15‑MKL1介导的白血病发生。此外，RBM15和RBM15‑MKL1融合蛋白均通过RBM15的SPOC结构域与组蛋白赖氨酸N‑甲基转移酶SETD1B相互作用。这种与SPOC结构域的相互作用对于RBM15‑MKL1促进AMKL细胞增殖和存活的致白血病作用至关重要。因此，RBM15‑MKL1的致白血病作用可能至少部分是通过改变SETD1B依赖的表观遗传程序介导的。此外，RBM15与RNA剪接蛋白剪接因子3B亚基1 (SF3B1)和U2AF94结合。HSCs中RBM15的缺失会导致血小板生成素受体MPL的选择性剪接，从而产生截短形式的MPL。这种异常亚型会损害血小板生成素信号传导，并降低HSCs移植到小鼠体内后的植入率。RBM15‑MKL1与在5‑7%的BCR‑ABL阴性骨髓增生性肿瘤中发现的过度激活的MPL（通过MPLW515L突变）协同作用，在小鼠中诱导急性髓系白血病(AMKL)的发生，提示RBM15‑MKL1可能通过异常调控剪接来驱动白血病发生。然而，RBM15‑MKL1是否影响m6A修饰尚不清楚，目前也尚无研究将AMKL患者中RBM15‑MKL1的高表达与m6A水平的改变联系起来。

RBM15‑MKL1融合蛋白的部分效应可能归因于MKL1，MKL1作为血清反应因子（SRF）的转录共激活因子，激活与细胞周期和巨核细胞分化相关的基因。与天然MKL1蛋白不同，后者在血清刺激或Rho GTPase激活后可在细胞质和细胞核之间穿梭，而RBM15-MKL1则完全定位于细胞核内。因此，RBM15‑MKL1能够组成性地激活SRF依赖性转录。此外，RBM15‑MKL1还能增强重组结合蛋白抑制因子（recombining binding protein suppressor of hairless，RBPJ）的转录活性。这一过程依赖于RBM15的RNA识别基序（介导其与RBPJ的相互作用）以及MKL1的转录激活结构域（转录激活所必需的结构域）。RBM15–MKL1通过RBPJ介导的转录激活对于经基因工程改造表达该融合蛋白的AMKL细胞的生长至关重要。因此，RBM15的m6A调节功能可能并不参与RBM15–MKL1融合蛋白的致癌作用。

m6A通路中另一个与癌症相关的突变是METTL14R298P突变。据cBioPortal报道，METTL14中的R298P突变是一种罕见事件，在分析的10,953例患者中仅有7例发现。当这种突变出现时，它通常与子宫内膜癌相关，存在于1.5%的子宫内膜癌肿瘤中，并显著改变METTL3-METTL14甲基化复合物的甲基化活性。R298残基位于该复合物假定的RNA结合槽附近，因此对靶标识别至关重要。在子宫内膜癌细胞中杂合敲入R298P突变可增强细胞增殖和肿瘤形成。同样，METTL14-R298P的过表达促进肝癌细胞的生长。这种突变改变了m6A写入复合物的结合偏好，导致转录组中出现新的m6A修饰模式。MYC被确定为METTL14-R298P的关键下游靶点，因为MYC mRNA的甲基化促进了致癌转录程序。在METTL14的R298位点，在胰腺癌和结肠腺癌等癌症中发现了其他罕见突变（R298H和R298C），这些突变同样改变了底物结合特异性。在胆管癌中，R298H变体则表现为功能丧失突变，这与METTL14在该背景下的抑癌作用相一致。

然而，METTL14‑R298突变的致癌潜仍有待充分阐明。关于该突变是否足以启动肿瘤、其对维持肿瘤的必要性以及其对肿瘤进展的具体影响阶段等关键问题仍未得到解答。此外，选择性靶向METTL14‑R298P作为治疗策略的潜也尚未得到探索。

除了m6A修饰酶的突变外，mRNA中的同义突变（synonymous mutations）也被证明会影响RNA的甲基化能力。例如，在细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A (CDKN2A)和乳腺癌2型易感蛋白 (BRCA2)中已发现去除m6A位点的此类同义突变，导致mRNA稳定性降低和肿瘤发生增强。

m6A的转录失调。导致m6A模式改变的机制可能包括剪接改变，这在癌症中经常观察到。由于甲基化在长的内部外显子中发生得更加有效（图1），因此改变外显子大小的剪接事件可能会影响甲基化化学计量。  转录速度是影响m6A甲基化模式的另一个因素。转录速度慢会导致mRNA上m6A甲基化效率更高，而RNA聚合酶II的快速转录活性则会降低甲基化水平。因此，转录速度的改变，例如当RNA聚合酶II延伸缺陷时（这种情况已在乳腺癌和白血病中报道，可能导致m6A模式的失调。mRNA生物合成过程中m6A甲基化的确切时间尚不清楚。  目前尚不清楚m6A的形成是发生在转录过程中、剪接前或剪接后，还是发生在完全加工的mRNA上。然而，m6A模式的改变可能源于mRNA生命周期不同阶段甲基化动态的变化。因此，绘制新生、加工和成熟mRNA转录本上的m6A图谱，有助于深入了解甲基化失调的时间。

m6A的代谢失调。癌症中的代谢改变也会影响m6A的调控。一些报道表明，癌症中已报道的SAM水平改变可以调节METTL3的甲基化效率。然而，SAM水平调节METTL3的观点与先前报道的METTL3催化甲基化反应中SAM的Km值相矛盾，该Km值约为102nM。SAM的这种高亲和结合表明，METTL3的活性对SAM水平的波动基本不敏感，预计SAM水平将保持在微摩尔范围(>10µM)。

在异柠檬酸脱氢酶1 (IDH1) 或IDH2 发生突变的癌症中，突变酶获得新的活性，将α-酮戊二酸(α-KG) 转化为癌代谢物R-2-羟基戊二酸 (R-2HG)。R-2HG的结构与α-KG相似，它作为α-KG依赖性双加氧酶（包括FTO和其他去甲基化酶）的竞争性抑制剂发挥作用。因此，R-2HG可以通过抑制甲基化酶的功能来增加m6A水平。对于FTO而言，它在急性髓系白血病 (AML) 中可能发挥癌基因的作用（详见下文），IDH突变可以绕过对FTO活性的依赖性。R-2HG抑制其他α-KG依赖性肿瘤抑制性双加氧酶，例如TET2，从而增强MYC表达和肿瘤细胞存活。在胶质瘤模型中也观察到了类似的效果，这凸显了代谢调控和遗传背景在决定FTO致癌作用方面存在的情景依赖性相互作用。

METTL3的细胞定位。尽管在大多数细胞系中METTL3位于细胞核内，但在某些细胞系以及肺癌、胃癌和前列腺癌的活检样本中，METTL3也表现出胞质定位。在胞质中，METTL3可能通过增强致癌mRNA的翻译发挥作用。在肺腺癌中，胞质METTL3同时结合靶mRNA的m6A修饰的3′UTR和真核起始因子3H (eIF3H)，后者与mRNA帽结构相关。这种相互作用诱导mRNA环化，从而促进核糖体重新进入，进而增强翻译。该机制被认为能够促进m6A依赖性的表皮生长因子受体 (EGFR)、具有PDZ结合基序的转录共激活因子 (TAZ)、含溴结构域蛋白4 (BRD4)和CD9的翻译增加。METTL3也可能通过与胞质聚腺苷酸结合蛋白1 (PABPC1)结合并稳定其与5′端帽结合复合物eIF4F的相互作用，来促进非m6A修饰的mRNA 的翻译。因此，METTL3在翻译过程中可能具有催化依赖性和非催化依赖性功能。

METTL3的胞质定位也可能降低核甲基化水平。在乳腺癌中，METTL3的乙酰化增强了其胞质定位，导致核内METTL3减少。这种甲基化模式的改变会影响mRNA的稳定性，最终导致转移和侵袭能下降。

m6A调控癌症相关信号通路

m6A可通过甲基化参与这些通路的关键靶转录本，显著影响多种信号通路，包括PI3K‑AKT‑mTOR和WNT‑β‑catenin通路。例如，在急性髓系白血病（AML）中，METTL3介导的甲基化导致细胞信号传导发生改变，从而直接或间接地导致包括MYC、BCL2、PTEN和SP1在内的⼏种关键癌症相关转录本水平升高（图2）。MYC mRNA高度富含m6A修饰，且m6A似乎直接调控MYCmRNA。在急性髓系白血病（AML）细胞中，m6A缺失会增加MYC mRNA水平，而在造血⼲细胞（HSCs）、宫颈癌细胞和结直肠癌细胞中，则会降低MYC水平。此外，m6A缺失还会降低AML细胞和胸腺癌细胞中MYC的翻译。m6A在不同细胞环境下对MYC产生不同影响的能力，以及其促进MYC翻译的能力，表明MYC的5′UTR已经进化出利用m6A的非常规方式。这可能涉及改变RNA结构或诱导独特的蛋白质‑RNA相互作用。

图 2 | m6A调节因子在白血病中的致癌作用。在急性髓系白血病中，甲基转移酶样蛋白3 (METTL3) 和METTL14通过其N6-甲基腺苷 (m6A) 甲基转移酶活性驱动肿瘤发生，导致MYC、BCL2、PTEN 和 MYB 等致癌蛋白水平升高。这些致癌蛋白表达升高是由靶转录本上m6A沉积增加介导的，从而增强mRNA的稳定性，并可能提高翻译效率。YTH结构域蛋白1 (YTHDC1) 通过与m6A修饰的转录本（例如MYC和GINS1）结合，发生液-液相分离，形成动态核凝聚体。这些核体在急性髓系白血病细胞中增多，并保护mRNA免受外泌体介导的降解。含有YTH结构域的家族蛋白2 (YTHDF2) 是一种m6A阅读蛋白，它能结合并破坏关键mRNA（例如肿瘤坏死因子受体超家族成员2 (TNFRSF2)）的转录本，从而调控白血病干细胞 (LSC) 的功能。相反，去甲基化酶alkB同源物5 (ALKBH5) 通过去除m6A标记来稳定致癌转录本（例如转化酸性卷曲螺旋蛋白3 (TACC3) 和受体酪氨酸激酶AXL），从而促进LSC的活性。类似地，脂肪量和肥胖相关蛋白 (FTO) 能增强致癌靶点（包括MYC和CCAAT/增强子结合蛋白-α (CEBPA)）的稳定性，进一步促进白血病的进展。同时，FTO会减少分化促进转录本（如视黄酸受体-α (RARA) 和锚蛋白重复序列
(RARA) 及SOCS盒蛋白2 (ASB2)）上的m6A修饰，这会破坏这些mRNAs的稳定性并抑制分化，从而进一步促进白血病发生。

参与关键细胞生长和信号通路（包括PI3K-mTOR、RAS-RAF、MEK-ERK、转化生长因子-β (TGFβ) 和WNT-β-catenin通路）的转录本中m6A修饰的增加，与通路激活和转移促进密切相关。此外，m6A水平升高与细胞迁移、侵袭和转移增强有关。例如，在结直肠癌和前列腺癌中，METTL3的缺失会损害体外细胞的迁移和侵袭能力。在乳腺癌脑转移病例中，先前与转移相关的基因（包括α-N-乙酰半乳糖胺α2,6-唾液酸转移酶5(ST6GALNAC5)、间隙连接α-1蛋白(GJA1)和EGFR的mRNA中的m6A修饰会增加它们的稳定性。这种稳定性进一步促进脑转移，增强癌细胞与脑内皮细胞和星形胶质细胞的相互作用。

m6A写入复合物的其他组分，例如METTL14和前体mRNA剪接调节因子WTAP，也与癌症信号通路相关。这些蛋白目前已知的唯一功能是促进m6A催化，因此任何与这些蛋白相关的致癌机制都被认为是m6A依赖性的。具体而言，这两种蛋白均与m6A在癌症相关转录本上的沉积有关，包括EGFR、MYC和CTNNB1（编码β-catenin），通过增强这些靶标的稳定性和翻译，影响细胞增殖、信号传导和细胞周期进程。

m6A阅读蛋白也参与肿瘤发生相关的信号通路。YTHDC1通过控制核内MYC mRNA的稳定性来促进AML细胞的存活和分化（图2）。尽管YTHDF阅读蛋白在mRNA去稳定化方面的作用已得到证实，但关于它们在癌症中的作用仍存在相互矛盾的数据。例如，YTHDF2似乎在胶质母细胞瘤中会使LXRA和HIVEP2转录本不稳定，但在其他情况下，它对关键致癌mRNA（如MYC）具有稳定作用，并且血管内皮生长因子受体(VEGFR)的表达得以维持。这些发现提示可能存在细胞类型特异性因子，这些因子可以将YTHDF2的一般mRNA去稳定化功能转化为mRNA稳定化功能。这种可能性值得进一步研究。

除了作为写入酶和读取酶外，m6A擦除酶在癌症信号通路中也发挥着依赖于情景的作用。例如，ALKBH5促进急性髓系白血病（AML）、乳腺癌、胶质母细胞瘤和妇科癌症中癌症⼲细胞的自我更新。在AML中，ALKBH5通过转录后调控转化酸性卷曲螺旋蛋白3（TACC3）和受体酪氨酸激酶AXL来促进白血病⼲细胞（leukaemia stem cell，LSC）的维持。

对于FTO而言，已有报道指出其对致癌和抑癌信号通路具有情景依赖性效应。在急性髓系白血病（AML）中，FTO过表达通过阻断髓系分化、增强有氧糖酵解和维持白血病干细胞更新来促进白血病进展。从机制上讲，FTO介导的m6A去甲基化可稳定致癌mRNA，例如MYC和血小板磷酸果糖激酶（PFKP），同时以m6A依赖的方式抑制其他mRNA，例如锚蛋白重复序列和SOCS盒蛋白2（ASB2）（图2）。小分子FTO抑制剂（例如FB23和CS1）在临床前研究中显示出强大的抗白血病作用。在黑色素瘤中，FTO上调通过稳定PDCD1（编码PD1）和其他mRNA来阻碍抗PD-1疗法。在乳腺癌或胃癌中，FTO通过m6A依赖性调控关键mRNA和长链非编码RNA来降低细胞凋亡并促进转移。FTO在肝细胞癌、卵巢癌和乳头状甲状腺癌中也发挥抑癌作用。在肝细胞癌中，FTO下调促进肿瘤进展，这种下调是由SIRT1诱导的FTO SUMO化介导的。在卵巢癌干细胞中，FTO通过增强环磷酸腺苷 (cAMP) 信号传导和磷酸二酯酶基因PDE1C和PDE4B的mRNA去甲基化来降低干性。在乳头状甲状腺癌中，FTO通过IGF2BP2依赖性方式使载脂蛋白E (APOE) mRNA不稳定来抑制糖酵解和细胞生长。

m6A在癌症信号通路中的潜在抑癌作用。尽管m6A修饰程序通常与肿瘤发生相关，但多项研究表明，在某些情况下，METTL3和METTL14可以发挥抑癌基因的作用。METTL14缺陷通过降低整体m6A水平，并抑制PH结构域富含亮氨酸重复序列的蛋白磷酸酶2 (PHLPP2)，以及增强mTORC2复合物三个组分（包括PRR5、PRR5L和mTOR本身）的RNA稳定性，从而促进致癌的AKT信号通路，进而增强子宫内膜癌细胞的增殖和致瘤性。因此，在某些情况下，m6A的减少可能通过调节某些细胞类型中表现出抗癌作用的特定mRNA来抑制肿瘤。

m6A和癌症中的表观遗传失调

m6A修饰发生在细胞核内，与转录同时发生或转录后不久发生。一些研究表明，由于组蛋白的翻译后修饰，RNA甲基化机制被募集到染色质上。METTL3似乎也能直接结合某些转录因子，包括急性髓系白血病(AML) 中的CCAAT/增强子结合蛋白‑ζ (CEBPZ)。通过这种方式，METTL3可以优先靶向特定的转录本，包括一些编码控制细胞命运的转录因子（例如SP1）。

m6A和核凝聚体（nuclear condensates）

m6A可通过其核内阅读器YTHDC1影响表观遗传调控。YTHDC1在细胞核内聚集形成颗粒状结构，这些结构最初被称为YT bodies。这些凝聚体与核斑点（nuclear speckles, 由SC35核标记物标记）、超级增强子凝聚体（由BRD4标记）和其他核体（nuclear bodies）部分重叠，表明细胞核内存在复杂的空间动态。

YTHDC1颗粒可能反映了其在多蛋白凝聚体中的富集。已知YTHDC1通过结合m6A mRNA进入凝聚体，因为在m6A缺陷细胞中，YTHDC1不再富集于凝聚体。当YTHDC1与具有多个m6A位点的RNA结合时，它很容易发生相分离，这可能增强其进入凝聚体的能力。这种机制类似于胞质YTHDF蛋白，它们同样定位于凝聚体，依赖于与m6A mRNA的结合。YTHDF胞质凝聚体有助于应激颗粒、P小体和其他RNA颗粒的形成，这些颗粒能够实现区室特异性的转录后调控。

YTHDC1凝聚体似乎能够调控染色质相互作用并募集转录调控因子，从而导致基因抑制或激活。支持这一观点的是，YTHDC1介导的转录激活与增强子相关凝聚体的形成有关，这些凝聚体能够募集共激活因子BRD4。新生RNA m6A修饰谱分析表明，包括增强子RNA在内的转录调控元件会被选择性地进行m6A修饰。这些m6A标记的增强子RNA与高活性增强子相关，它们能够募集YTHDC1，促进核内凝聚体的形成，其中一些凝聚体与BRD4相互作用，从而驱动基因激活。

除了与超级增强子凝聚体相互作用以驱动基因激活外，YTHDC1在维持核斑点完整性方面也发挥着重要作用。核斑点通常与活跃的转录位点相邻，并参与正常和转录应激条件下的基因表达调控。核斑点形成的关键成分是核长非编码RNAMALAT1，已知其经过大量m6A修饰。MALAT1中m6A位点的缺失会破坏YTHDC1定位到核斑点，而YTHDC1的缺失会导致斑点内蛋白质组成发生改变，这凸显了YTHDC1在核斑点组装中的作用。

核斑点的另一个关键组成部分是SON蛋白，其mRNA也是细胞中m6A修饰程度最高的mRNA之一。SON与造血⼲细胞（HSCs）命运调控密切相关，m6A的缺失会破坏SON蛋白的丰度和核斑点的形成，从而降低HSCs的自我更新能力和分化潜能。这些研究强调了m6A‑YTHDC1凝聚体与其他核凝聚体之间的相互作用，从而协同调控基因表达。

除了在基因激活中的作用外，YTHDC1凝聚体还能保护m6A修饰的转录本免受核降解，从而增强致癌信号传导。例如，在AML细胞中，YTHDC1‑m6A凝聚体隔离MYC mRNA并保护其免受外泌体相关的RNA降解。

YTHDC1核凝集物的蛋白质组组成仍未完全明确。然而，已有研究表明RBMX与YTHDC1相互作用。此外，RBMX还能结合某些m6A修饰的转录本，这种结合是由m6A诱导的RNA二级结构线性化所促进的，线性化过程暴露出一个可被RBMX9识别的RNA结合基序。这种相互作用对于新生RNA转录本尤为重要，RBMX通过RNA聚合酶II在转录过程中与其结合，从而参与共转录剪接的调控。在急性髓系白血病（AML）中，RBMX控制异染色质蛋白CBX5的新生转录，并且是髓系白血病发生所必需的。区分RBMX对新生转录的调控是否依赖于YTHDC1或m6A，或者是否独立发挥作用，这一点至关重要。在某些情况下，RBMX可能独立于这些因子发挥作用，参与调控特定转录本，例如AML中的CBX5。需要进一步研究来阐明这些相互作用及其相关的分子机制。

m6A和表观遗传调控因子

许多研究YTHDC1相互作用组的研究发现了表观遗传调控因子，支持了m6A可通过YTHDC1影响表观遗传状态的观点。据推测，X非活性特异性转录本（XIST）介导的基因沉默因其m6A修饰而增强，这导致YTHDC1和染色质修饰因子（如多梳抑制复合物1 (PRC1)）在293T细胞和小鼠胚胎干细胞中的募集。然而，YTHDC1与XIST结合导致基因沉默的机制仍不清楚。最近的研究表明，组蛋白修饰因子在YTHDC1与m6A修饰的转录本结合后与其相互作用，尽管关于其对基因表达影响的报道有时并不一致。例如，内源性逆转录病毒元件（endogenous retroviral elements, EREs）上的m6A修饰可通过YTHDC1诱导转录抑制，YTHDC1可募集H3K9甲基转移酶SETDB1和三方基序28（TRIM28），从而在小鼠胚胎干细胞中建立H3K9me3。相反，YTHDC1也被证实可募集H3K9去甲基化酶KDM3B至关键发育基因，例如Jam2、Hoxc12、Cbln1和Tbx3，从而促进这些基因在小鼠胚胎干细胞中的表达。目前尚不清楚是什么决定了YTHDC1与H3K9甲基转移酶或去甲基化酶相互作用的特异性，从而调控基因表达。

此外，YTHDC1在染色质相关调控RNA（chromatin-associated regulatory RNAs, carRNAs）的核转录降解中也发挥着相反的作用。YTHDC1与m6A修饰的carRNAs结合，并通过YTHDC1与核外泌体靶向复合物的结合促进其降解。这种降解会使附近的基因表达失活，这与YTHDC1通过增强子相关凝聚体增加转录的作用形成对比。

总体而言，m6A在RNA稳定性和基因表达中发挥的相反作用在各种类型的新生RNA中均有体现，包括carRNAs、pre‑mRNAs和EREs。这引发了关于这些不同效应的调控机制及其在不同细胞环境中的调控方式的关键问题。深入了解癌细胞中的这些机制对于理解m6A如何根据细胞和癌症类型促进或抑制肿瘤至关重要。

m6A控制细胞状态和分化

m6A调控的关键在于其对情景的依赖性效应，尤其是在发育的特定阶段，m6A会影响细胞命运的决定。小鼠胚胎⼲细胞的研究就是一个很好的例子。在原始多能性状态下，METTL3的缺失会导致分化失败，这是由于多能性相关转录本（如Oct4和Nanog）的稳定性增加所致。然而，在已启动的胚胎⼲细胞中，METTL3的缺失会导致分化增强。这些发现强调了METTL3缺失时细胞所处的特定状态对于决定最终表型的重要性。类似地，在正常造血⼲细胞（HSCs）中，METTL3的缺失会导致功能异常的⼲细胞扩增，这些⼲细胞无法正常分化，其表型与原始多能⼲细胞相似。相反，在急性髓系白血病（AML）细胞中，METTL3的缺失会促进髓系分化并降低增殖。

尽管METTL3在源自癌症⼲细胞的癌症中发挥重要作用，例如在急性髓系白血病（AML）和胶质母细胞瘤模型中，但METTL3在分化型肿瘤中也同样必需，例如源自上皮细胞的肿瘤，包括结直肠癌、前列腺癌和肺癌。这表明m6A的调控机制可能因肿瘤细胞的起源而异。然而，并非所有研究都能明确定义分化状态和起源细胞，其与特定类型癌症⼲细胞状态的确切关联仍不清楚。但是，这些观察结果表明，METTL3的作用取决于细胞环境、需要不同的转录程序才能存活或分化的特定细胞状态。

还应注意的是，m6A的精确含量也可能很重要。例如，有报道称，利用基因敲低方法，METTL3在胶质母细胞瘤中既可以作为抑癌基因，也可以作为癌基因发挥作用，这表明m6A的水平可能导致肿瘤中不同的功能结果。

m6A调控细胞状态的另一个例子体现在转移过程中。研究表明，m6A可通过上皮间质转化（EMT）促进转移。EMT相关基因，包括E‑钙黏蛋白(CDH1)和波形蛋白(VIM)，受关键转录因子核因子I/B (NFIB) 的调控。NFIB mRNA上的m6A修饰可稳定其表达，从而维持EMT相关因子的转录程序，进而促进前列腺癌转移。然而，这种mRNA稳定作用并不像m6A通常对转录本的去稳定作用那样常见。

其他m6A调节因子也表现出细胞情景依赖性作用。例如，YTHDF2的耗竭可选择性地消除LSCs，同时促进正常HSCs的扩增及其植入能力。类似地，ALKBH5的耗竭会导致LSCs的丢失，同时保留和维持正常的HSCs。

因此，m6A在各种细胞环境中可以发挥双重作用，根据m6A阅读器、写入器或擦除器的表达、细胞类型和分化状态，发挥促肿瘤和抑肿瘤作用。

m6A调节增殖和DNA损伤

m6A在关键的细胞过程中发挥着至关重要的作用，包括细胞周期进程和DNA损伤反应。这些过程对于正常细胞功能和癌症进展都至关重要，凸显了在疾病背景下靶向m6A调控的治疗潜和挑战。

m6A和细胞周期进程

已知m6A可驱动细胞不受控制的增殖。m6A在调控细胞周期进程中的作用最初是在神经祖细胞模型中提出的。在皮层神经祖细胞中，METTL14的缺失会导致S期到M期转换的延长和细胞周期退出的延迟，从而导致神经祖细胞数量减少。通过对小鼠胚胎发育第13.5天（E13.5）的前脑进行m6A测序（该发育阶段富含神经⼲细胞），研究人员鉴定出了富含m6A的转录本，其中包括编码细胞周期、⼲细胞和神经元分化调控因子的转录本。这一发现强调了m6A在确保发育中的神经组织内细胞分裂及时进行方面的关键作用，并提示其失调可能导致细胞增殖增加。

在包括结直肠癌和食管胃交界处腺癌在内的多种癌细胞模型中，一些细胞周期相关基因，例如CDC25B、CDC25A和CCND1，是m6A甲基化的直接靶点。m6A的缺失通常会导致这些细胞的细胞周期延迟，从而在体外产生抗增殖和抗癌效应。这种表型凸显了靶向m6A调控因子在癌症治疗中的应用潜力。然而，值得注意的是，METTL3、METTL14和其他m6A甲基化复合物的组成成分是必需基因。因此，许多研究中观察到的细胞表型可能间接来源于细胞死亡，而非直接反映其在细胞周期中的调控作用。靶向这些组分进行治疗可能会产生毒性。因此，在开发基于m6A的疗法时，必须仔细考虑其潜在的毒性作用。

然而，m6A缺失对细胞周期进程的影响取决于具体情况。例如，在造血干细胞（HSCs）中，m6A耗竭反而会促进细胞增殖。这种差异表明，与m6A对分化的影响类似，干细胞中可能存在其他依赖于具体情况的调控机制，影响着细胞周期进程，而癌细胞则不然。需要进一步研究来阐明这些机制及其对靶向m6A疗法的潜在意义。

m6A和DNA损伤反应

m6A在促进DNA损伤修复方面也发挥着关键作用，而DNA损伤修复对于遭受基因毒性压的细胞的存活至关重要。当暴露于紫外线照射等DNA损伤因子时，m6A标记会动态地添加到DNA损伤位点合成的RNA上。这些新引入的m6A位点对于募集DNA聚合酶κ（Polκ）至关重要，Polκ是跨损伤合成途径中的关键酶，该途径使细胞能够绕过DNA损伤并完成复制。通过将Polκ募集到损伤位点，m6A能够实现高效的DNA修复，从而促进细胞在基因毒性应激下的存活。

人们可以预测，这种m6A介导的募集过程对于DNA修复机制更依赖于跨损伤合成修复途径的癌细胞来说尤为重要；例如，对于BRCA突变的癌细胞来说，m6A介导的募集过程可能尤为重要。这种依赖性使得m6A成为潜在的治疗靶点，可用于抑制DNA修复。与此观点一致的是，研究发现METTL3抑制剂与PARP抑制剂奥拉帕尼具有协同作用，可在异种移植研究中抑制前列腺癌的进展。此外，据报道，在肺腺癌中，METTL3缺陷会通过下调mutS同源物5 (MSH5)（参与DNA错配修复）来损害同源重组修复的效率。因此，METTL3抑制可使肺癌细胞对PARP抑制剂更加敏感。

m6A调节先天免疫信号传导和细胞死亡

来自不同领域的新证据表明，METTL3抑制会导致类似病毒的双链RNA（dsRNA）的诱导，从而触发抗病毒免疫反应。这包括激活I型⼲扰素（IFN）信号通路，并随后诱导IFN刺激基因（IFN-stimulated genes, ISGs）的表达，这些基因可以刺激抗肿瘤免疫，并激活进化上保守的、用于保护细胞免受病毒感染的内在细胞死亡机制。因此，METTL3抑制剂的作用可能源于其对肿瘤细胞的直接作用以及对靶向肿瘤的免疫细胞的影响（图3）。值得注意的是，m6A抑制还可以增加编码IFNβ的转录本以及ISGs的转录调节因子的表达，这些因子也有助于ISG的诱导。

图 3 | m6A对dsRNA和ISG的调控是其在癌症中发挥作用的关键。N6-甲基腺苷 (m6A) 抑制双链RNA (dsRNA) 的形成，其机制可能是通过沉默内源性逆转录病毒的转录元件、控制正确的剪接以及维持核斑点功能。内源性dsRNA可被先天免疫传感器识别，包括视黄酸诱导基因I (RIG-I)、黑色素瘤分化相关蛋白5 (MDA5)、蛋白激酶R (PKR) 和2′-5′-寡腺苷酸合成酶1 (OAS)。OAS在识别dsRNA后合成2′-5′-寡腺苷酸，激活RNA酶L降解RNA并抑制病毒复制。干扰素刺激基因
(ISGs) 的后续激活可增强抗肿瘤免疫力，诱导癌细胞死亡，并可能诱导分化。dsRNA也是双链RNA特异性腺苷脱氨酶 (ADAR1) 的靶标，ADAR1可降低dsRNA的表达，从而进一步抑制ISG，并促进肿瘤的免疫逃逸。RNA Pol II，RNA聚合酶II；YTHDC1，含YTH结构域蛋白1；YTHDF，含YTH结构域家族蛋白。

m6A抑制也可能稳定ISGs转录本，因为已发现许多ISGs被YTHDF2修饰和降解。因此，抑制m6A通路可能导致炎症表型。这一假设得到了在病毒感染条件下利用遗传学方法进行的研究的进一步支持。然而，在AT3乳腺癌细胞中的研究发现，使用METTL3抑制剂治疗并不能提高ISGs mRNA的稳定性，这暗示在m6A丢失后，可能存在其他通路驱动ISGs激活。值得注意的是，在METTL3抑制之前，ISGs mRNA通常不表达，这表明m6A通路抑制可能在ISGs转录诱导后增强其水平方面发挥更重要的作用，而不是启动其表达。

在癌细胞以外的多种细胞类型中，m6A抑制均可导致ISGs上调，这表明METTL3抑制剂可能至少部分通过激活非癌细胞的固有免疫反应而间接发挥抗癌作用。然而，在m6A水平升高的癌细胞中，m6A升高可能具有抑制dsRNA和固有免疫反应的功能。因此，METTL3抑制剂也可能通过抑制这种重要的m6A依赖性生存机制发挥作用。

METTL3抑制剂激活先天免疫反应，促进免疫细胞浸润，从而增强肿瘤免疫监视，进而促进AT3乳腺癌细胞过继性T细胞转移模型中的抗肿瘤免疫。利用m6A抑制实现ISGs激活，为提高抗肿瘤免疫和免疫疗法的疗效提供了一种有前景的方法，因为促免疫刺激的环境能够增强肿瘤对这些治疗方式的敏感性。以下详述的多项证据支持了这些概念。

在小鼠HSCs中，Mettl3敲除导致dsRNA的积累，激活dsRNA传感器视黄酸诱导基因I（RIG‑I）和黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5），从而触发IFN反应并激活蛋白激酶R（PKR）。PKR磷酸化eIF2α，从而损害整体翻译，而RIG‑I通路促进ISGs的转录和翻译。这种表型也见于γδT细胞，其中METTL3缺失导致dsRNA增加和信号转导及转录激活因子1（STAT1）信号通路增强，最终导致具有细胞毒性的γδ T1细胞与γδ T17细胞（与支持肿瘤生长的炎症微环境相关）之间的失衡。值得注意的是，在多种癌细胞系（例如人卵巢癌细胞、小鼠AT3三阴性乳腺癌细胞和B16黑色素瘤细胞）中，METTL3的药理学抑制也会导致dsRNA上调和ISGs激活。这些发现凸显了m6A在调节dsRNA和ISGs表达中的作用，这是一种在不同细胞环境中保守的机制。

关于m6A缺失如何导致dsRNA增加的一种假说是，m6A的功能是破坏RNA结构，因此其缺失会导致dsRNA增加。然而，值得注意的是，YTHDF2的缺失也会导致ISGs的诱导，并且YTHDF2缺陷细胞中的mRNA具有升高的m6A水平。因此，更可能的是，通过抑制METTL3或YTHDF来抑制m6A通路足以诱导ISGs。m6A耗竭诱导dsRNA的另一种机制是EREs的去抑制，这些元件易于形成dsRNA。在大多数情况下，源自EREs的dsRNAs的积累会诱导ISGs的表达。在胚胎⼲细胞中，m6A通过募集染色质调节因子（例如SETDB1和TRIM28）来沉默逆转录转座元件，例如内源性逆转录病毒、长散在核元件和短散在核元件。因此，m6A的缺失可能导致这些元件的重新激活，进而触发dsRNA的形成和ISG的激活。

m6A缺失后，失调的剪接也会导致双链RNA（dsRNA）增加。如上所述，m6A通过影响核斑点组分MALAT1来调控剪接。m6A的缺失会导致核斑点显著改变，从而损害共转录剪接。在免疫冷肿瘤(immune-cold tumors)（例如MYC扩增的癌症）中，已使用剪接体功能的药理学抑制剂证实了剪接受损对dsRNA的影响。这种抑制作用会导致内含子滞留水平升高，而这些滞留的内含子更可能包含反向重复元件（例如短散在核元件或Alu元件），这些元件可以激活RIG-I通路。此外，核斑点蛋白SON的过表达可逆转METTL3缺陷型造血干细胞（HSCs）中dsRNA的积累，部分原因是逆转了内含子滞留，从而使ISG信号正常化并挽救HSC功能。然而，这些反向重复元件与EREs（似乎更丰富）相比的相对贡献尚不完全清楚。

dsRNA增加的一个主要后果是ISG激活，随后引发多种细胞效应，包括细胞死亡。细胞死亡由Z‑DNA结合蛋白1（ZBP1）介导，ZBP1与dsRNA结合诱导坏死性凋亡（necroptosis）。然而，在不同的背景或条件下，dsRNA也可能诱导其他形式的细胞死亡，例如凋亡或细胞焦亡。dsRNA是否能够诱导细胞死亡，仍有待进一步研究。坏死性凋亡是METTL3抑制后细胞死亡的主要形式，或者当其他通路参与该过程时也是如此。值得注意的是，m6A缺失会导致ZBP1表达上调，这提示METTL3抑制可能通过诱导dsRNA及其效应分子ZBP1来诱导细胞死亡。

ISG激活的另一个重要后果是影响肿瘤免疫微环境。m6A耗竭导致ISG表达，包括趋化因子（如CXCL10或CCL5）的表达，以及与IFNγ反应和I型IFN反应相对应的整体表达模式，这些反应与强烈的免疫激活相关。因此，这些ISGs可能影响抗肿瘤反应，并提高免疫检查点抑制剂的疗效。事实上，最近的研究表明，用METTL3抑制剂治疗荷瘤小鼠可诱导免疫反应，促进CD8 T细胞募集和抗原依赖性杀伤。检查点抑制剂在METTL3抑制背景下增强抗癌作用可能源于双重机制：一是ISG介导的免疫细胞刺激，二是肿瘤细胞中ZBP1介导的及其他死亡通路激活增强。在免疫功能正常和免疫缺陷的条件下比较METTL3抑制的实验，有助于深入了解各通路各自的作用。

值得注意的是，METTL3抑制剂还会显著损害T细胞和树突状细胞的发育和反应。此外，m6A的缺失也会通过影响肿瘤微环境增强肿瘤的转移潜能。例如，髓系细胞特异性的m6A缺失会损害SPRED2的翻译，从而通过ERK通路增强NF-κB和STAT3的激活，最终导致肿瘤生长和转移增强。这些发现强调了确保METTL3抑制不会损害关键的免疫介导的抗肿瘤机制的重要性。值得注意的是，由于细胞对m6A缺失的反应似乎具有细胞类型特异性，因此，确定这些细胞类型特异性反应的潜在机制对于开发安全有效的靶向m6A通路的治疗策略至关重要。

注意，dsRNA水平可通过dsRNA特异性腺苷脱氨酶（ADAR）降低，该酶可将腺苷脱氨为肌苷，从而降低dsRNA的稳定性并抑制下游ISG的响应。因此，ADAR表达或诱导水平的差异可能导致细胞对m6A通路抑制的不同反应。一个可验证的假设是，将METTL3抑制与ADAR抑制相结合是否能通过增强dsRNA和ISG的响应来促进细胞死亡，从而为靶向以腺苷为基础修饰的癌细胞提供一种新方法。

以m6A为靶点的癌症治疗

由于抑制m6A可以阻断促肿瘤的m6A依赖性通路并触发先天免疫反应，因此它是一种很有前景的癌症治疗靶点。我们概述了m6A靶向治疗领域未来有前景的研究方向（表2），包括旨在增强抗肿瘤效果并最大限度降低脱靶⻛险的精准治疗方法。

表2 | m6A 靶向药物

首个同类METTL3抑制剂STM2457由STORM Therapeutics公司开发，该公司通过对超过250,000个化合物进行高通量筛选，随后对效力、吸收、分布、代谢和排泄（adsorption, distribution, metabolism and excretion, ADME）特性以及体内药代动力学进行了严格的优化。STM2457对METTL3-METTL14的半数抑制浓度为16.9 nM，X射线晶体衍射分析表明STM2457与METTL3-METTL14异二聚体的SAM结合位点结合。这种特异性是通过以下几个结构因素实现的：STM2457独特的结构，与SAM或其他已知的甲基转移酶抑制剂不同；它能够避开SAM所利用的同型半胱氨酸结合口袋；以及其他机制，例如结合后的构象重排。

在临床前研究中，STM2457显示出强大的抗白血病作用，可促进细胞凋亡和分化，同时延缓体内白血病的发生。这种疗效与整体m6A甲基化水平的降低以及致癌驱动基因（如MYC、SP1和BRD4）翻译水平的下降相关。值得注意的是，STM2457可诱导肿瘤内源性免疫反应，为在免疫肿瘤学领域潜在的协同应用铺平了道路。在临床前模型中，STM2457与抗PD‑1疗法联合使用可增强抗肿瘤活性，凸显了一种有前景的治疗策略。

继STM2457取得成功后，STORM Therapeutics公司将STM2457的更强效衍生物STC‑15推进至I期临床试验。早期结果表明，STC‑15在多种剂量下均具有良好的耐受性，生物标志物数据提示其能够靶向结合并激活与临床反应相关的先天免疫通路。这些结果凸显了METTL3抑制剂作为一种治疗策略的潜力，其作用机制不仅在于直接杀伤癌细胞，还在于重塑肿瘤微环境以增强免疫监视功能。

除了METTL3的小分子抑制剂外，还开发了靶向METTL3的小分子降解剂（表2）。值得注意的例子包括蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs），例如ZW27941和WD6305，它们能够募集E3连接酶Von Hippel-Lindau，从而诱导METTL3和/或METTL14的靶向降解。对于ZW27941和WD6305，METTL3和METTL14均能被有效降解，导致AML模型中m6A甲基化水平降低和细胞活力下降，凸显了它们作为抗癌药物的潜力。PROTACs还将靶向METTL3的非催化功能，包括其在胞质溶胶中的非经典作用，例如调节肺癌、前列腺癌和胃癌中的翻译，如先前所述。然而，这两项研究都强调需要进一步优化，并在动物模型中进行验证，以提高选择性和体内疗效。这些步骤对于确定PROTACs在癌症治疗中是否优于STC-15，或者是否会导致任何额外的毒性至关重要。

m6A擦除器的抑制剂也是癌症治疗领域一个很有前景的研究方向。例如，FTO抑制剂（表2）可以同时影响m6A和m6Am的调控。FTO的这种双重作用增加了复杂性，尤其是在目前关于FTO抑制导致m6Am水平升高影响的研究有限的情况下。因此，需要进一步研究来厘清m6A和m6Am对观察到的表型的贡献，并阐明FTO抑制剂在癌症治疗中的应用潜力。

ALKBH5抑制剂的研发尚不成熟，但由于ALKBH5参与促进急性髓系白血病（AML）和胶质母细胞瘤的肿瘤进展、免疫逃逸和治疗耐药，因此ALKBH5抑制剂正成为新兴的研究热点。ALKBH5小分子抑制剂（表2）已在临床前研究中展现出抑制其去甲基化酶活性和抑制肿瘤细胞增殖的潜力。

近年来，小分子疗法的进展主要集中在靶向m6A阅读蛋白以精确调控肿瘤特异性过程。有机硒化合物依布硒仑（ebselen）作为一种新型的YTHDF蛋白m6A结合域抑制剂，能够破坏YTHDF m6A结合域与m6A修饰的mRNA靶标之间的相互作用。然而，依布硒仑缺乏特异性，因为它无法区分三个YTHDF旁系同源蛋白的结合域，这给其靶向治疗应用带来了挑战。

类似地，利用体外高通量筛选和基于结构的药物化学方法，已经开发出靶向YTHDC1的抑制剂（表2）。这些化合物主要与保守的YTH结构域结合，但仍需进一步研究以确定其选择性，评估与其他含有YTH结构域的蛋白质的交叉反应性，并确定最佳治疗剂量。

开发m6A阅读器抑制剂的关键挑战在于如何实现所需的特异性，以区分YTHDC1抑制剂和靶向YTHDF蛋白的抑制剂的作用。此外，区分密切相关的YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3蛋白同样至关重要，因为它们具有高度相似的结合域，但在m6A介导的RNA调控中可能发挥不同的功能作用。分子动学研究表明，这种困难源于它们m6A结合域的高度相似性。尽管靶向这些蛋白质的其他表面区域可能提供一种潜在的解决方案，但由于缺乏明确的结合口袋或结构限制，这些区域通常被认为难以成药。因此，需要开展进一步的研究，以确定克服这些挑战并实现对特定m6A阅读器的选择性靶向的可行策略。

结论与未来方向

m6A RNA修饰是癌症生物学中的核心调控因子，影响RNA稳定性、翻译、剪接和免疫反应。尽管相关证据仍在不断涌现，但m6A可能影响癌症代谢重编程，这代表了一个有前景的未来研究方向。m6A定位技术的进步加深了我们对m6A在癌症中的化学计量和功能意义的理解。然而，需要将更新的定量m6A定位方法重新应用于癌症样本，以充分验证先前提出的失调m6A位点。最近一篇预印本报告指出，在使用定量m6A定位时，FTO对任何可检测到的m6A位点均无影响，这与现有文献相矛盾，因此有必要重新分析m6A图谱。此外，针对m6A写入酶、擦除酶和读取酶的新兴治疗方法为抑制癌症特异性通路提供了有前景的途径。然而，在实现特异性、最大限度减少脱靶效应以及理解m6A修饰的情景依赖性作用方面，仍然存在挑战。持续的研究对于完善这些策略并发挥m6A的治疗潜力至关重要，这将为更有效、更具针对性的癌症治疗铺平道路。

未来研究的关键问题在于确定哪些癌症类型和治疗方案最有可能最大程度地提高METTL3抑制剂和其他靶向m6A通路药物的疗效。鉴于m6A在免疫调节和DNA损伤修复中的作用，将METTL3抑制剂与免疫检查点抑制剂或DNA损伤药物（例如PARP抑制剂）联合使用可能产生协同效应。联合使用靶向其他表观遗传调控因子的抑制剂是否有效？我们如何预测哪些患者会从中获益？敏感性和耐药性的驱动因素是什么？靶向mRNA甲基化程序的其他组成部分（例如FTO、ALKBH5、YTHDC1和YTHDFs）是否会更有效？这些问题可能将通过STC‑15的临床经验直接得到解答，随后对治疗后的遗传和表观遗传反应进行详细分析。此外，对肿瘤进行全面的分子谱分析对于识别预测这些抑制剂疗效的关键生物标志物至关重要。功能基因组学和表观转录组学分析也有助于阐明敏感性和耐药性的潜在机制，从而指导筛选最有可能从联合疗法中获益的患者。还需要开展进一步的临床前和临床研究，以评估靶向不同癌症背景中mRNA甲基化程序特定成分的疗效。

然而，由于m6A在正常细胞分化和生理功能中的重要性，必须密切监测潜在的副作用，包括造血毒性和血细胞减少症。值得注意的是，在最初使用STM2457治疗不同基因型AML患者来源的异种移植模型的研究中，每日给予小鼠50 mg/kg体重的STM2457剂量并未影响骨髓来源的造血⼲细胞和早期祖细胞的数量、外周血细胞计数或小鼠体重。

一项重要的技术考量是不同研究中使用的基因敲低或耗竭程度，这可能是导致不同研究中观察到的表型复杂多样的原因之一。目前已证实，m6A调节因子对整体m6A水平的影响并非线性关系，部分或不充分的耗竭会导致不同的结果，从而使实验结果的解读变得复杂。例如，Schwarz等人的研究表明，将METTL3和/或METTL14的敲低程度（至野生型对照组的10%）并未导致m6A水平出现明显的下降，直到进一步敲低至野生型对照组的5%时，m6A水平才出现显著下降。因此，必须进行剂量依赖性评估，并仔细检查m6A丢失和调节因子耗竭的程度，才能得出准确的结论。

这些见解为癌症治疗的新前沿奠定了基础，选择性m6A修饰抑制可能为治疗以异常m6A甲基化模式为特征的恶性肿瘤提供新的途径。

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