Target-BS技术揭示糖尿病引发勃起功能障碍的DNA甲基化调控机制：项目文章

勃起功能障碍（Erectile Dysfunction, ED）是指男性无法获得或维持足够完成性行为的勃起能力。全球有超过1.5亿男性患有ED，预计到2025年患者数量可能超过3.2亿。ED的常见病因包括衰老、糖尿病和心血管疾病。目前，磷酸二酯酶5抑制剂（PDE5Is）是治疗ED的一线药物，但约35%的患者对其无效。研究表明，DNA甲基化是一种通过DNA甲基转移酶（DNMT）作用而不改变DNA序列的化学修饰，能够调控基因表达。eNOS（内皮型一氧化氮合酶）甲基化可抑制其表达，进而导致内皮功能障碍。然而，目前尚不清楚低雄激素水平和1型糖尿病是否通过甲基化eNOS启动子区域来引发ED。

近日，西南医科大学附属医院王娜医生为第一作者、姜睿教授为通讯作者，在《Andrology》（IF 4.5/Q2）杂志发表了题为《Methylation of eNOS in the rat penile corpus cavernosum under different pathological states and its relationship with erectile function》的科研成果。研究探讨了1型糖尿病和低雄激素状态对大鼠阴茎海绵体组织中eNOS基因启动子区域甲基化水平的影响及其与勃起功能的关系。研究结果为基于不同病因的ED个体化治疗方案提供理论依据。

本研究将58只8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为6组（每组6只）：假手术组、去势组、去势+睾酮（cast+T）组、正常血糖组、糖尿病组和糖尿病+甲基转移酶抑制剂（5-aza-dc，1.5 mg/kg）组。在假手术组、去势组和去势+睾酮替代组中，术后4周检测最大海绵体压力/平均动脉压（ICPmax/MAP）、血清睾酮（T）、一氧化氮（NO）浓度、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和eNOS的表达以及大鼠阴茎海绵体中eNOS启动子区域的甲基化水平。在正常血糖组、糖尿病组和糖尿病+甲基转移酶抑制剂组中，使用甲基转移酶抑制剂6周后进行上述检测。

分析结果揭示了去势组大鼠的ICPmax/MAP、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、eNOS和NO水平显著低于假手术组和去势+睾酮组。糖尿病组大鼠的ICPmax/MAP、eNOS和NO水平较低，而DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达水平显著高于正常血糖组和糖尿病+甲基转移酶抑制剂组。去势组大鼠阴茎海绵体中eNOS启动子区域的甲基化水平与假手术组或睾酮替代组之间无显著差异。糖尿病组大鼠阴茎海绵体中eNOS启动子区域的甲基化水平显著高于正常血糖组和糖尿病+甲基转移酶抑制剂组。

研究结果表明，尽管低雄激素状态抑制了大鼠阴茎海绵体组织中甲基转移酶的水平，但并未影响eNOS启动子区域的甲基化水平。高血糖通过上调阴茎海绵体组织中甲基转移酶的水平和eNOS启动子区域的甲基化水平，抑制了阴茎海绵体组织中NO的水平和大鼠的勃起功能。甲基转移酶抑制剂可以部分改善1型糖尿病大鼠的勃起功能。

研究方法

实验动物与分组：58只8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为6组（每组6只）：假手术组、去势组、去势+睾酮替代组、正常血糖组、糖尿病组和糖尿病+甲基转移酶抑制剂（5-aza-dc）组。

勃起功能检测：通过测量最大海绵体压力/平均动脉压（ICPmax/MAP）评估勃起功能。

组织学检测：采用免疫组化和Western blot检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和eNOS的表达。

NO浓度检测：采用比色法测定海绵体组织中一氧化氮（NO）浓度。

DNA甲基化测序：采用靶基因DNA甲基化测序（Target-BS）技术检测eNOS启动子区域的甲基化水平。

研究结果

（1）体重、ICPmax/MAP、血糖和血清睾酮

体重：糖尿病组和糖尿病+甲基转移酶抑制剂组大鼠体重显著低于正常血糖组，而假手术组、去势组和去势+睾酮替代组之间无显著差异。

ICPmax/MAP：去势组大鼠在3V和5V电刺激下的ICPmax/MAP显著低于假手术组和去势+睾酮替代组。糖尿病组的ICPmax/MAP显著低于正常血糖组和糖尿病+甲基转移酶抑制剂组。

血糖：糖尿病组和糖尿病+甲基转移酶抑制剂组血糖显著高于正常血糖组。

血清睾酮：去势组血清睾酮水平显著低于假手术组和去势+睾酮替代组，而糖尿病组和糖尿病+甲基转移酶抑制剂组与正常血糖组之间无显著差异。

图1：通过ICPmax/MAP评估每组大鼠的勃起功能。

（2）免疫组化

去势组大鼠海绵体组织中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达水平显著低于假手术组和去势+睾酮替代组。糖尿病组大鼠海绵体组织中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达水平显著高于正常血糖组和糖尿病+甲基转移酶抑制剂组。

图2：免疫组化检测大鼠海绵体组织中 DNMT1 、 DNMT3a 和 DNMT3b 的表达水平。

（3）Western blotting

去势组大鼠海绵体组织中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和eNOS的表达水平显著低于假手术组和去势+睾酮替代组。糖尿病组大鼠海绵体组织中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达水平显著高于正常血糖组和糖尿病+甲基转移酶抑制剂组，而eNOS表达水平显著降低。

图3：Western blotting检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和eNOS的表达水平。

（4）eNOS 中启动子区域的甲基化测序

去势组大鼠海绵体组织中eNOS启动子区域的甲基化水平与假手术组和去势+睾酮替代组之间无显著差异。糖尿病组大鼠海绵体组织中eNOS启动子区域的甲基化水平显著高于正常血糖组和糖尿病+甲基转移酶抑制剂组。

图4：通过靶基因DNA甲基化测序（Target-BS）检测了eNOS启动子区域的甲基化水平。

(A) 假手术组、去势组和去势+睾酮（cast+T）组eNOS启动子区域甲基化水平图表；

(B) 正常血糖组、糖尿病组和糖尿病+甲基转移酶抑制剂组eNOS启动子区域甲基化水平图表；

(C-D) eNOS启动子区域甲基化水平的统计图表。

易小结

本研究揭示了低雄激素状态和1型糖尿病对大鼠阴茎海绵体组织中eNOS基因启动子区域甲基化水平的不同影响。糖尿病通过上调甲基转移酶水平和增加eNOS启动子区域的甲基化，抑制eNOS表达和NO水平，进而导致ED。甲基转移酶抑制剂能够部分改善糖尿病大鼠的勃起功能，但其效果有限。未来的研究应进一步探索2型糖尿病对eNOS甲基化的影响，并开发更具选择性甲基化调控策略，以实现靶向ED的精准治疗。

Target-BS技术在本研究中的重要作用

Target-BS技术在本研究中用于检测eNOS启动子区域的甲基化水平。该技术通过设计特异性引物、DNA亚硫酸盐转化、目标基因甲基化扩增、PCR产物文库构建和文库质量控制测序等步骤，精确测量了eNOS启动子区域的甲基化状态。研究结果表明，糖尿病组大鼠海绵体组织中eNOS启动子区域的高甲基化水平与eNOS表达水平的显著降低密切相关，而甲基转移酶抑制剂（5-aza-dc）能够部分逆转这种甲基化状态，从而改善勃起功能。这一发现揭示了DNA甲基化在糖尿病引发的ED中的关键作用，并为开发靶向eNOS甲基化的治疗策略提供重要依据。

DNA甲基化研究基本思路

DNA甲基化一般遵循四个步骤：

首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析，包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。

其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。

再次，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。

最后，对筛选出的目标区域DNA甲基化进行验证，通常采用靶基因重亚硫酸盐测序（Target-BS）。

参考文献：

Wang N, Jiang Q, Xie L, Cheng B, Liu QW, Jiang R. Methylationof eNOS in the rat penile corpus cavernosum under different pathological statesand its relationship with erectile function. Andrology. 2023 May 24. doi:10.1111/andr.13465.