光遗传技术+小胶质细胞+启动子+血清型
ChR2、eBR、NpHR3.0、Arch 都是光遗传学中常用的光敏蛋白（opsins），它们的功能主要区别在于：
是否激活或抑制细胞；
对光的波长响应；
反应速度与稳定性
光刺激可以驱动细胞行为，但不知道具体激活哪条通路
光遗传可以控制神经元细胞的激活和失活，但是不能控制具体的信号通路，如果是特定细胞类型，需要用转录组+抑制剂干预+功能分析，明确了光控的下游
脑立体定位仪准确注射
文献-1--小胶质细胞的研究
结果一：体外验证光遗传学操纵小胶质细胞去极化体系-先上体外实验
CMV-ChETA-EYFP的慢病毒感染BV2细胞和原代小胶质细胞
检测-膜片钳技术+细胞吞噬荧光标记微珠/突触体/Aβ（可以直接加到培养基里面）
结果二：构建光遗传学在体操纵小胶质细胞去极化吞噬Aβ的动物模型-上动物
Cx3cr1-creER小鼠与Ai27小鼠
Cx3cr1-creER::Ai27小鼠与5xFAD小鼠杂交--上疾病模型（同时做了外源性给与Aβ）
5xFAD小鼠
是一种常用的阿尔茨海默病（AD）小鼠模型，主要用于研究阿尔茨海默病的机制、病理特征以及潜在的治疗策略。该模型通过携带五个常见的阿尔茨海默病相关基因突变（因此命名为5xFAD）来模拟人类阿尔茨海默病的病理特征。
Ai27 小鼠
是一种常用于光遗传学研究的转基因小鼠模型，它通常用于标记和操作特定类型的细胞，特别是在神经科学和免疫学领域。
Rosa-CAG-LSL-hChR2（H134R）-tdTomato-WPRE--Ai27D 小鼠在暴露于 Cre 重组酶后表达改进的通道视紫红质-2/tdTomato 融合蛋白。这些小鼠可用于光遗传学研究，通过蓝光 （450-490 nm） 照射快速体内激活可兴奋细胞。
结果三：光遗传学激活的小胶质细胞吞噬突触能力增强
修剪不是随机吞噬——
小胶质细胞不是只吞噬“垃圾”，而是精准识别并参与突触结构调控。
蛋白下降 ≠ 结构减少——
免疫印迹或免疫组化看到的蛋白量下降可能是转录调控、降解加快等，也可能不是修剪。形态学变化更直接有力。
机制链闭环——
功能增强 → 分子改变 → 结构变化，构成完整的因果逻辑闭环
==================突触相关标志蛋白================
蛋白定位类型代表意义
VGlut1突触前（囊泡）兴奋性突触 兴奋性突触数量与功能
PSD95突触后密度区 兴奋性突触 突触后结构成熟、功能完整性
Synaptophysin突触 前囊泡膜 所有类型突触总突触数或突触密度
===================突触修剪======================
突触修剪（synaptic pruning）是指在神经发育过程中，神经元之间的突触连接在大脑中根据功能需要进行选择性删除或减少的过程。这一过程是神经系统发育中的重要环节，尤其在大脑皮层发育和学习记忆的形成过程中起着至关重要的作用。
突触修剪的基本概念：
突触连接的选择性消除：在神经系统发育初期，大脑神经元之间会形成大量的突触连接，很多连接是多余的或不必要的。突触修剪通过对突触的选择性削减，保留有功能作用的突触连接，去除不活跃或不适用的突触，优化神经网络。
修剪的机制：突触修剪的机制受到多种因素的调控，主要包括：
活动依赖：神经元的活动模式对突触修剪起着重要作用。例如，活跃的突触连接更容易得到保留，而不活跃的连接则容易被修剪。
小胶质细胞的作用：小胶质细胞（microglia）在突触修剪过程中扮演着重要角色。它们通过吞噬和清除不必要的突触，帮助清理神经网络中不必要的连接。
分子信号：一些分子信号（如C1q、MHC I类分子、Cx3cr1等）能够引导小胶质细胞识别和吞噬不需要的突触。
突触修剪的时间性：
在早期发育阶段，突触修剪会非常活跃，尤其是在大脑皮层和其他重要的脑区中。这一过程通常在婴幼儿时期最为显著。
随着大脑发育，突触修剪逐渐减少，但它仍然在一些神经回路的重塑中发挥作用，如在学习和记忆过程中。
突触修剪的功能：
提高大脑效率：通过删除不必要的连接，突触修剪帮助大脑优化其信息传递效率。
支持学习和记忆：突触修剪是大脑在学习新信息时对神经回路进行塑形的关键步骤。它使得神经网络更加有效地执行任务和处理信息。
维持神经网络稳定性：修剪过程有助于去除损伤、无效或病变的神经连接，保持神经系统的健康与稳定。
突触修剪的异常：
突触修剪的异常与多种神经系统疾病相关，例如：
在**自闭症谱系障碍（ASD）**中，突触修剪可能受到影响，导致神经网络连接过多或不适当。
精神分裂症和抑郁症也与突触修剪的紊乱有关，可能导致大脑的突触修剪过程出现异常。
作者用AAV-hSyn-Cre和AAV-EF1a-DIO-EYFP联合的双病毒神经元稀疏标记系统，可以清晰地标记单个神经元形态
LoxP -- Lox2272 -- [←目标基因反向排列] -- LoxP -- Lox2272
结果四：抑制补体系统使光遗传学激活的小胶质细胞选择性吞噬Aβ，减弱其突触清除能力
研究者在光刺激的Cx3cr1-creER::Ai27小鼠脑室中注射C1q抗体--开始就做了光纤和套管植入-方便后续给药
眶后注射AAVPHP病毒是指将一种特定类型的腺相关病毒（AAV，Adeno-Associated Virus）载体通过眶后（即眼眶后方）直接注射到小鼠或大鼠的眼眶后部，目的是将病毒载体递送到眼眶后及周围的组织，特别是到达大脑的脑干区域，如中缝背核（dorsal raphe nucleus）。这种方法通常用于靶向大脑深部区域的基因递送，特别是当我们需要递送基因到脑干或其他难以到达的脑区时。
AAVPHP病毒的特点
AAVPHP是AAV家族中的一种变种，特别擅长通过外周注射递送基因并能够有效穿越血脑屏障。它与其他AAV载体相比，具有更高的效率和更广泛的跨血脑屏障能力。这意味着通过AAVPHP病毒载体进行基因递送后，目标基因能够在深层脑区（例如脑干或中缝背核）发挥作用，而不需要进行侵入性手术（如直接脑部注射）。
实验中的应用
眶后注射通常是为了将病毒递送到大脑中缝背核（这个区域含有5-羟色胺能神经元，即5-HT神经元），这些神经元与情绪调节、社交行为、焦虑等多种行为相关。
在实验中，研究者可能会通过将病毒载体AAVPHP与ChRmine等光敏蛋白基因一起递送到目标神经元，之后通过光激活技术控制这些神经元的活动，从而研究其在社交行为或其他行为任务中的作用。
在这个实验设计中，研究者使用了AAV8-CamKIIα::ChRmine-oScarlet-Kv2.1病毒，通过注射到大鼠的大脑不同深度，来测试经颅光传递激活表达ChRmine的神经元的深度极限。下面是对这些成分的解释：
1.AAV8（腺相关病毒AAV8）
AAV8是一种常用于基因传递的病毒载体，具有良好的跨血脑屏障能力和较低的免疫原性，常用于大脑或中枢神经系统的基因递送。它被广泛应用于小鼠、大鼠和其他哺乳动物的基因治疗研究中。
2.CamKIIα
CamKIIα是一个特定的启动子，用于驱动转基因在兴奋性神经元中的表达，尤其是大脑皮层和海马等区域的神经元。它能确保在表达ChRmine的病毒载体中，只有特定类型的神经元（即兴奋性神经元）表达光敏蛋白。
3.ChRmine
ChRmine是一种新型的光通道蛋白，具有优异的深度光激活特性。它能够响应特定波长的光（通常是蓝光），并通过打开离子通道来调控神经元的去极化，从而激活神经元的活动。
研究者使用ChRmine来对神经元进行经颅光调控，而ChRmine的深度激活能力使得它成为深层脑区激活的理想选择。
4.oScarlet
oScarlet是一种红色荧光蛋白，用作标记工具。在该实验中，它帮助研究者可视化和追踪表达ChRmine的神经元，方便在成像中观察其位置和状态。
5.Kv2.1
Kv2.1是一种钾离子通道蛋白，通常与神经元的动作电位的恢复和稳定有关。它的作用是在ChRmine光激活后的去极化之后帮助恢复神经元的静息电位，有助于控制神经元活动的时序
我们发现全身性与颅内注射靶向神经元的光激活能力没有差异，尽管全身性病毒递送的感染复数较低
控制浅层脑区的方式
1.改变病毒递送的方式
局部注射：相比全身性或通过颅内注射的方式，可以尝试将病毒通过局部注射直接注入到目标浅层脑区。这种方式可以确保病毒高浓度地递送到浅层区域，减少对深层脑区的影响。
浅层脑区特异性病毒载体：可以使用经过改造的病毒载体，如AAV系列病毒的不同变种，选择具有更强靶向浅层脑区的特性。例如，可以考虑使用AAV2/1、AAV1等，这些病毒通常更容易感染脑皮层和其他浅层区域的细胞。
2.优化病毒载体
选择特异性启动子：使用特异性启动子来增强病毒在浅层脑区的表达。例如，选择hSyn（突触特异性启动子）用于标记皮层神经元，或CamKIIα（主要在皮层兴奋性神经元中表达）等启动子。这些启动子能够增强浅层神经元的病毒表达。
优化AAV病毒类型：不同类型的AAV病毒对脑区的靶向能力不同。AAV5、AAV9、AAV2等常用于深部脑区，但AAV1、AAV2等病毒更容易感染皮层和浅层脑区。可以尝试使用AAV1或AAV2，以提高浅层脑区的递送效率。
3.增加光激活的有效性
使用更强的光源：在进行光遗传学实验时，确保使用适合的光源来确保浅层脑区神经元的有效激活。可以尝试增加光源的强度（例如，增加光纤的功率密度），以便光信号能够有效到达目标浅层脑区。
使用更高效的光纤和光纤系统：为了精确控制浅层脑区，可以使用光纤植入物，这些光纤可以直接放置在浅层脑区上方，从而更精确地控制光刺激的范围和强度。
4.采用非侵入性递送方法
经颅光传递：一种非侵入性的方法是使用能够穿透颅骨的光源来进行光遗传学调控。例如，采用经颅光刺激的方法，使用高光激活深度的光通道蛋白（如ChRmine）结合适当的光源，从而实现浅层脑区的光激活。这样的技术可以通过调整光源位置和强度来实现浅层区域的精准调控。
5.考虑病毒递送的深度和扩散
注射位点选择：确保病毒递送的注射部位接近目标浅层脑区。通过微调注射深度，可以确保病毒更有效地在目标脑区内扩散，而避免过深注射导致递送到深层脑区。
优化递送时间与浓度：通过优化递送的病毒浓度和感染时间，可以增加浅层脑区细胞的感染率，从而提高光遗传学实验的效果。
6.其他基因递送系统
超声波递送系统：目前有研究探索了使用超声波（如聚焦超声波）来增强基因或药物递送到脑内。超声波可以帮助病毒通过血脑屏障到达大脑表层或浅层脑区，这样可以提高浅层脑区的递送效率。
7.选择适当的行为学实验
行为学测试的选择：对于浅层脑区的控制，可以选择与大脑皮层相关的行为学任务，如空间学习任务、迷宫测试、视觉和听觉刺激反应等。这些测试能够有效评估浅层脑区的功能变化，进一步验证光遗传学干预的效果。
小鼠小胶质细胞的原代分离培养
培养板的包被
（1）将盖玻片裁成0.5cm×0.5cm大小，浸洗、烘干。
（2）经5%盐酸浸泡30min，自来水冲洗20min，三蒸水冲洗，浸泡过夜并烘干；移入95%酒精浸泡保存。用前酒精灯烤干，放入24孔细胞培养板。
（3）用0.01%的L-多聚赖氨酸溶液包被培养皿和小玻片，37℃恒温孵育4h或常温过夜。去除L-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片，晾干备用。小鼠小胶质细胞的混合培养
（1）75%（体积分数）酒精消毒新生24h内的清洁级小鼠，在无菌条件下断头，剪开头皮及颅骨，取出脑组织，置于盛冷的pH7.2，无钙、镁的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。
（2）无菌剥离脑组织，除去小脑、海马、大脑髓质，分离大脑皮层，仔细剥离脑膜及血管。
（3）用虹膜膜将组织剪切成1mm3左右的组织块，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用20min，期间振摇2~3次。
（4）弃去上清液，加入完全接种液终止消化，漂洗两次。巴斯德吸管轻轻吹打至肉眼观察无明显的脑组织团块，静置2min。
（5）县液收焦干新的离心管，离心（1000r/min.10min.4℃），弃去 清液。加入完全培养液重悬，200目不锈钢网过滤。根据实验需要接种于若干个25cm细胞培养瓶或培养皿中。
（6）置37℃、5%CO2培养箱培养24h后更换一次培养基，以后每3d换一次液，并在镜下观察细胞的生长和存活情况。小胶质细胞的分离和纯化
（1）细胞培养14～16d左右，在倒置相差显微镜下可观察到混和胶质细胞培养物中出现细胞分层现象，即底层为扁平、多种形状的、具有多个突起的星型胶质细胞，小胶质细胞明显偏小呈类圆形、折光性强，附着于星型胶质细胞表面生长。
2）倒掉培养液，用0.05%胰酶2~3mL消化，边观察边轻晃动培养瓶，等到贴附在星形胶质细胞上的小胶质细胞脱离下来，将含漂浮的小胶质细胞的消化液转入10mL离心管，立刻用完全培养基终止消化。
（3） 离心管配平，1000r/min，离心5min，弃上清；加定量完全培养再次吹打成细胞悬液，接种于预先包被的置有盖玻片的24孔培养板，置于CO2恒温细胞培养箱（37度）培养。
（4）生长24h后吸掉培养液，以去除未贴壁的少突胶质细胞，加完全培养液继续培养。
脑组织中不同细胞类型的启动子
重点！！！！！！！！！！
共有 0 条评论