破壁新生：原代细胞分离术全解析

原代细胞分离是生物医学研究的基石技术，其核心是通过物理或生物化学方法将组织解离为单细胞悬液，并保留细胞活性和功能。将活体结构成分（如活体器官、活体组织、活体细胞等）甚至活的个体从体内或其寄生体内取出，置于类似于体内生存环境的体外环境中生长和发育的方法。人或动物体内(或胚胎组织)由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来。体外培养分为全部培养及部分培养，而部分培养又分三种即器官培养、组织培养和细胞培养：

■器官培养：器官培养（organ culture）是将活体的一部分进行分离培养，是广义的组织培养形式之一。将部分或整体器官在不损伤正常组织结构的条件下进行的培养，即仍保持组织的三维结构，并模仿在各种状态下的器官功能。广义的器官培养技术还包括将整个胚胎或者有机体的大部分结构进行培养的技术。器官培养的小块器官材料也是植块，只不过这种植块与组织培养的植块有本质上的差别。

■组织培养：组织培养是将组织块直接进行培养，使之在体外条件下存活和生长。组织培养过程中，细胞自组织块周围迁移出来并生长；在生长过程中，细胞总有移动或其他的变动，这样就使得被培养的组织难以长期维持其原有的结构和功能。培养时间越长，发生变动的可能性就越大，结果常使单一类型的细胞保留下来，最终也成了细胞培养。

■细胞培养：细胞培养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。

原代细胞分离常用的方法

1悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1500-3000r/min离心15-30分钟。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。

2实体组织材料的分离方法

对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。

①机械分散法丨特点：简便、快速,但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差,适用于处理纤维成分少的软组织。

②消化分离法丨组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。

Ⅰ酶消化分离法丨酶消化分离法常采用胰蛋白酶、胶原酶和中性蛋白酶：胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开；胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用；

中性蛋白酶一种非特异性金属蛋白酶，由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的，属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。在一定温度、PH值下，本品能将大分子蛋白质水解为氨基酸等产物。可广泛应用于动植物蛋白的水解，制取生产高级调味品和食品营养强化剂的HAP和HVP，此外还可用于皮革脱毛、软化、羊毛丝绸脱胶等加工。除上述三种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶。

Ⅱ非酶消化法(EDTA消化法)丨EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂或Versene，全名为Ethylenediaminetetraacetic acid。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。

Ⅲ消化分离法的操作步骤丨处死，取材，清理，剪切，消化，终止，过滤，离心，漂洗，接种，纯化。

消化分离法常用试剂推荐;

Ⅳ消化分离法的注意事项丨组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用；胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用；消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，避免膨松的细胞随漂洗而丢失。