Nature丨单细胞测序揭示神经元的基因表达谱与其形态和功能之间的关系

https://www.nature.com/articles/s41586-024-08518-2

2025年2月27日德国马普学会生物智能研究所等团队联合攻关，发表在Nature主刊题为：Transcriptomic neuron types vary topographically in function and morphology。研究背景是探讨神经元的基因表达谱与其形态和功能之间的关系：神经元的形态、连接和功能等表型特征在很大程度上由不同基因的特定差异表达组合所决定；转录组空间中聚类的神经元通常对应不同的细胞类型，而且在秀丽隐杆线虫神经元和视网膜神经节细胞等模型中，相同转录组类型的神经元已被证明可以共享形态和功能。斑马鱼中脑视顶盖由将视觉输入转化为运动输出的神经元组成，其视拓扑映射虽然连续，但顶盖的不同子区域在功能上具有专门化。为揭示顶盖神经元的细胞类型架构，本研究对斑马鱼顶盖神经元进行了单细胞转录组测序分析，鉴定出60多种转录组定义的神经元类型，这些细胞类型分布于特定的解剖层中。研究者通过双光子钙成像记录了数以千计顶盖神经元对视觉刺激的活动，并将这些神经元的功能响应与各自的转录组特征相匹配；此外，利用特定转基因品系对按照转录组类型鉴定的神经元进行了形态学分析。结果显示，即使属于同一转录组类别的神经元，其形态、神经连接和视觉响应也会因所在位置的不同而呈现显著差异；将神经元的空间坐标纳入分析后，在每一种转录组簇内进一步识别出在功能和形态上明显不同的解剖学亚群。上述研究表明，外部的、与位置相关的因素拓展了基因表达相似神经元的表型多样性，意味着仅凭基因表达谱无法完全预测神经元的功能和形态。

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背景介绍

神经元的基因表达谱与其形态和功能之间存在密切联系。 大量研究表明，神经元的形态、连接方式以及功能等表型特征在很大程度上由特定的基因表达组合所决定。在转录组空间中聚类的神经元往往对应着不同的细胞类型，而且在某些情况下，这些通过转录组定义的类型在形态和功能上也表现出相应的相似性。基于此概念，神经科学领域引入了“转录组细胞类型”（transcriptomic type, 简称t-type）的分类方法，认为每种神经元类型独特的基因表达模式决定了其发育轨迹，从而塑造出该细胞特有的形态（morphology, m-type）和功能（function, f-type）。模型生物的研究支持这种基因-表型对应关系：例如，秀丽线虫中118种解剖学上不同的神经元类型各自表达独特的转录因子组合，调控下游基因来决定神经元的形态及其在神经网络中的功能；果蝇中，不同神经元的差异基因表达谱与其特定的轴突或树突连线模式相对应。同样，在小鼠视觉皮层中，属于同一转录组类型的神经元在形态和电生理性质上表现出高度的一致性。这些发现共同阐明了神经元转录组与其形态、功能之间的紧密联系。 

然而，单凭转录组来定义细胞类型存在局限。 越来越多的证据表明，具有相似转录组特征的神经元在形态和功能上可能表现出明显的差异。传统观点假定转录组类型（t-type）、形态类型（m-type）和功能类型（f-type）三者是一一对应的关系，但事实上这种假设并不总是成立。神经元的功能反应以及树突或轴突形态常受到外部调制因素和可塑性机制的影响，这意味着同一转录组类型内部也可能存在显著的异质性。例如，在视觉皮层中，GABA能中间神经元对刺激的选择性调谐主要取决于动物的行为状态，而非其转录组类别。又如，小鼠大脑皮层中属于同一转录组类型的神经元在功能调谐特性上可能存在巨大差异，同时它们的形态连接模式也各不相同，表现为迥异的长程投射和局部回路。换言之，同一转录组定义的神经元不一定在形态和生理响应上完全一致。这些观察揭示了仅依据转录组划分细胞类型无法充分涵盖神经元的功能和形态多样性。 

神经元所处的空间定位及发育时序是影响其表型的重要外因。 鉴于基因表达谱不足以完全解释神经元表型的多样性，研究者开始关注外在因素（如细胞的空间位置和发育阶段）如何与转录组共同决定神经元的形态和功能。已有观点认为，神经元所在的解剖位置提供了一个关键的调控维度：不同区域的局部环境（例如可获得的形态发生因子或突触伙伴）可能对神经元的最终表型产生影响。在斑马鱼视顶盖（optic tectum, OT）中可以清楚地看到这种位置依赖效应。斑马鱼OT沿前-后和背-腹轴接受来自视网膜的高度拓扑映射输入，形成了与视觉空间对应的连续视野地图。在垂直于视顶盖表面的浅-深轴上，OT具有明显的分层结构：浅层的神经纤维层中，视网膜神经节细胞的轴突与视顶盖神经元的树突形成突触，而深层则是神经元胞体所在的围脑室层（SPV）。发育溯源研究显示，新生的神经元最初从近脑室区沿放射方向加入视顶盖，随后在发育晚期增添于视顶盖的后缘；较早出生的神经元会在成熟过程中逐渐被推移到表层的SPV层，并将神经突伸入浅层的神经纤维层。与此同时，诸如形态发生素、轴突导向因子和细胞表面分子等外在信号在发育进程中沿视顶盖三个轴向的浓度分布并不均一。这些证据表明，神经元在不同时空位置所经历的独特环境线索会影响其形态和功能表型，从而使基因表达相似的神经元表现出位置依赖的多样性。近年来的研究确实证实了这一点：外源的、位置依赖的因素能够拓展遗传背景相似神经元的表型范围，导致同一转录组类型的细胞在形态和功能上出现显著差异。

 斑马鱼视顶盖因此成为研究视觉处理与空间拓扑关系的理想模型系统。 斑马鱼OT是鱼类中脑顶盖的重要视觉处理中心，具有明确的层状组织结构和精细的视野拓扑映射。虽然视顶盖上的视野地图是连续的，但其中不同子区域已被发现具有特定的功能分工。这种结构特征使其非常适合探究神经元功能与空间位置的对应关系。尤其值得注意的是，斑马鱼幼体的大脑透明且视顶盖体积小，神经元数量适中，这为高分辨率地记录和分析整个视顶盖内神经元群提供了便利。研究者可以借助双光子钙成像等技术同时测量数千个视顶盖神经元对视觉刺激的反应，并结合多重原位杂交等方法确定这些神经元的分子表达特征。通过在单细胞水平关联每个神经元的转录组类型、形态特征、功能响应与其空间位置，斑马鱼视顶盖为理解基因表达谱与神经元表型和拓扑位置之间的关系提供了独特且强大的实验平台。

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科学问题与创新性

1.神经元转录组与表型关系的复杂性：尽管已有研究表明神经元的基因表达谱（转录组）与其功能和形态密切相关，但具体到特定脑区（如斑马鱼视顶盖），转录组定义的细胞类型在空间分布上如何与功能和形态表型相对应仍然不明确。本研究系统阐述了斑马鱼视顶盖神经元转录组类型在空间维度上的拓扑结构，以及这一结构与神经元功能响应和形态特征之间的关联性。

2.神经元表型空间分布的精细解析：尽管传统转录组学已实现对神经元类型的粗略分类，但在具体脑区内，同一转录组类型神经元在不同空间位置的功能和形态差异仍未清晰解析。研究利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合高分辨率空间标记技术，明确了斑马鱼视顶盖超过60种转录组定义的细胞类型在解剖层面的分布，并进一步揭示了不同空间定位的神经元在功能和形态上的差异。

3.功能成像与单细胞转录组的创新性整合分析：研究创新性地结合了单细胞转录组测序（scRNA-seq）和在体双光子钙成像技术，首次在单细胞水平上实现了神经元功能响应数据与转录组数据的精准匹配。这一方法的突破在于，它提供了一种在单细胞分辨率下同时解读转录组信息和实时功能响应的新途径，显著提升了对神经元功能异质性的理解。

4.形态与功能的拓扑分布规律：研究通过在特定转基因标记的斑马鱼品系中进行稀疏标记和三维形态重建，揭示了转录组相似的神经元在视顶盖不同空间区域呈现截然不同的形态与投射模式。这种空间依赖性的表型差异性为神经元分类标准的拓展提供了新的理论基础和实验证据。

5.空间位置和发育因素在神经元多样性中的作用：本研究强调了空间位置和发育时序对于神经元形态和功能多样性的调控作用，揭示了相同转录组类型神经元的空间位置依赖性表型多样化现象。这一发现突破了传统以转录组为唯一标准定义神经元类型的观点，提出了更为全面的神经元分类框架。

6.斑马鱼视顶盖作为视觉拓扑研究的模型创新：研究充分利用了斑马鱼视顶盖具有明确的分层结构、高空间分辨率以及连续视野拓扑映射的天然优势，成功建立了视顶盖神经元的空间转录组图谱和功能-形态关系。这不仅丰富了斑马鱼作为神经科学研究的模型系统的应用，也为后续视觉处理机制和神经元分类标准的研究提供了关键实验范式。

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 视顶盖的细胞类型具有分子多样性

为了全面描述斑马鱼视顶盖（OT）的转录组细胞类型（t-type）组成，我们对发育后6至7天（6–7 dpf）的斑马鱼幼体视顶盖进行了基于液滴的单细胞RNA测序（droplet-based single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）。我们共测序了45,766个细胞，这相当于对单个视顶盖半球中细胞数量（约6,000个神经元）的7倍以上的覆盖率。这些细胞根据其转录组特征被聚类为25个主要细胞簇（如图1a）。基于差异表达的簇特异性基因，我们鉴定出3个祖细胞簇、1个放射状胶质细胞簇、14个神经元簇，以及另外6个非神经元细胞簇。

随后，我们将处于有丝分裂后阶段的神经元（表达神经元标记基因elavl3的36,825个细胞）进行再次聚类（图1b）。去除注释不明确的细胞簇后，剩余的细胞簇被明确区分为兴奋性神经元（gad1b−, slc17a6a+和slc17a6b+）和抑制性神经元（gad1b+, slc17a6a−和slc17a6b−）（图2c,d）。最终鉴定出33个兴奋性转录组类型（t-types，簇编号为e1至e33，共15,866个细胞）和33个抑制性转录组类型（簇编号为i1至i33，共10,901个细胞）。其中20个神经元类型可用特异的差异表达基因作为单独的互斥性标记，而其余类型则需要多个稀疏表达基因的组合来明确定义（图1e,f）。总体而言，我们在斑马鱼幼体视顶盖中共识别出66个神经元转录组类型。值得一提的是，我们所鉴定的细胞类型和标记基因组合与近期一项斑马鱼视顶盖的研究有所不同：该研究在scRNA-seq前，首先使用特定增强子捕获品系进行荧光激活细胞分选（FACS），这导致数据偏向于被该品系标记的细胞群体，很可能未完整覆盖全部视顶盖细胞类型，并观察到更多不成熟神经元的比例。相比之下，我们的方法旨在囊括视顶盖所有细胞，因此能够更全面地揭示神经元和非神经元细胞群的丰富多样性。

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转录组类型在视顶盖中具有空间拓扑分布

为验证转录组类型（t-types）是否相对于视顶盖（OT）的空间三轴具有特定分布规律，我们选取了仅在单一或少数几个簇中表达的差异基因（图1），并通过多重RNA原位杂交链式反应（hybridization chain reaction, HCR）分析了它们的空间表达模式。我们将HCR表达模式对齐到标准的斑马鱼脑图谱（mapzebrain atlas，https://mapzebrain.org）中，测量了其在相同横断面和冠状面中的表达水平（图2）。

我们发现，这些基因定义的神经元类型在视顶盖浅-深（superficial-to-deep, SD）轴的特定区域显著富集。特别是，抑制性（GABAergic）神经元主要富集于围脑室层（stratum periventriculare, SPV）深部，而兴奋性（谷氨酸能，glutamatergic）神经元主要位于SPV浅表层，而胆碱能神经元则夹在二者之间。虽然大多数兴奋性和抑制性t-types总体上遵循这一分布规则，但也存在例外。例如，兴奋性标记基因bhlhe23在SPV深层神经元中表达，并被抑制性神经元标记（如insm2、chodl、npb和npy）所包围（图2）。而兴奋性标记基因ccka、onecut1、pitx2和zic2a仅限于浅层SPV的神经元表达（图2），cort、cckb和irx1b则表达于SPV中间层的神经元中（图2）。某些t-types如atf5b和sp5l则遍布SPV各个区域；抑制性标记基因esrrb和rpp25b呈现双层表达模式（图2）。相同标记基因的神经元彼此之间极少直接相邻（图2），提示同类神经元在SPV中呈镶嵌分布，类似视网膜中个别类型的视网膜神经节细胞（RGC）的排列方式。

为了获得视顶盖细胞类型结构的整体图像，我们手动标注了各神经元的质心位置（图2c,d），并测量每个t-type内神经元质心到其他所有t-type神经元最近邻的三维空间距离（nearest neighbour distances, NND）。然后，对每个t-type的平均NND矢量进行层次聚类（hierarchical clustering，图2e）。聚类的NND矢量揭示SPV明确分成三个解剖学层次：浅层、中间层和深层（图2e,f）。打乱标签的对照中，这种组织结构则消失。鉴于SPV浅表细胞比深层细胞更早出生，这一结果表明，类似视网膜发育，细胞类别和类型以预定顺序发育，兴奋性类型通常早于抑制性类型（图2）。

为了将外侧缰核中的snRNA-seq定义的细胞类型与岛叶、壳核和杏仁核中的细胞类型进行比较（图2A），我们对猕猴杏仁核（44,967个细胞）、岛叶（76,527个细胞）和壳核（39,439个细胞）中的细胞进行了UMAP聚类分析，并使用已知的标记基因对聚类进行注释。为了保证一致性，我们使用了来自相同两只猕猴供体的细胞，并将每个区域的细胞数下采样至大约15,000个细胞。对合并细胞的集成聚类分析显示，大多数聚类包括来自所有四个区域的细胞，尽管各区域的相对贡献不同。总体来看，外侧缰核的聚类与岛叶的聚类更为相似，而与壳核或杏仁核的聚类差异较大（图2B）。

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组合基因表达模式进一步明确了细胞类型在空间轴上的分布

空间分析所选的差异表达基因包括仅在单个或少数几个细胞簇中表达的标记基因。为了进一步探讨由标记基因组合定义的转录亚型在空间上的组织结构，我们针对分别表达atf5b和sp5l基因的细胞进行了迭代多重HCR标记，并考察它们的空间定位关系。我们重点关注转录因子和其他独特效应基因（主要编码神经肽和神经递质合成或转运蛋白）的组合表达模式。基因atf5b在簇e17中表达强烈，而在其他几个簇（如e6、e14、e21）中表达较弱（图1和图3）。基于簇e17的标记，我们深入探索了atf5b相关细胞类型的解剖排列。共表达atf5b和转录因子foxb1a或etv1的神经元在浅-深轴上呈现明显分隔，与已知的分子层类似；而与抑制细胞增殖的基因cebpa共表达的神经元则在浅表后区表现出较高密度（图3a,b）。类似地，共表达sp5l与效应基因uts1和chata的神经元分布在中间分子层，而与神经发生因子neurod1共表达的细胞则集中于后区（图3d,e）。总体上，无论由单个标记基因还是基因组合定义的细胞簇，都在浅-深轴方向上明显分层，而其在前-后轴（SPV）的分布则与神经发生因子及神经元自后缘增殖区向前缘分化的进程密切相关。

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同一细胞类型内神经元的视觉响应存在差异

接下来，我们检验了给定t-type内神经元是否具有一致的感觉或运动特征偏好。为此，我们利用转基因幼鱼（elavl3:H2B-GCaMP6s）进行了二维体积双光子钙成像，记录了视顶盖神经元对一系列行为相关视觉刺激的钙活动。这些刺激包括局部或整体运动线索：不同方向的运动点（连续或跳跃式运动，模拟中性、捕食或社交线索）、前向运动的光栅（触发视觉运动反应）、逐渐逼近的黑色圆盘（模拟捕食者或碰撞物）及环境亮度变化（图4a）。为了确定记录神经元的t-type，我们随后利用迭代多重HCR对最多六个互斥的标记基因进行标记（pitx2和ccka）。通过空间配准两个数据集，我们成功地为来自6条鱼的1,304个功能明确的神经元分配了特定的t-type（图4b及方法部分）。

我们发现每种t-type的神经元平均响应至少对两种刺激明显高于群体平均水平（图4c）。例如，运动的点和光栅对atf5b类型的神经元激发最强，而逼近刺激和OFF信号则在itpr1b类型神经元中表现最明显（图4c）。为了测试同一或不同t-type的神经元之间功能响应的相似性，我们计算了跨个体所有t-type神经元钙响应的相关性矩阵（图4d）。排序后的相关性矩阵显示，每个t-type内部及不同t-type之间存在明显的正负相关簇，表明每种t-type内部功能响应存在显著多样性，主要差异在于局部运动或整体运动偏好神经元的比例（图4d）。共表达pitx2和ccka的神经元（仅12个细胞）也表现出对局部和整体运动的混合反应，与单个标记基因定义的神经元类似。6个被检测的标记基因中，神经元之间的钙响应相关性在同一t-type内明显高于不同t-type之间（图4e）。我们因此得出结论，同一t-type神经元的视觉调谐并非完全一致，但整体上仍比其他类型更为相似。这一发现与哺乳动物上丘（OT的同源结构）的研究结果一致。

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转录组与空间位置共同决定神经元功能

接下来，我们研究了视顶盖中的功能响应类型（f-type）是否与特定的t-type相关联。为此，我们首先对未经过HCR标记但功能反应强烈的7,094个神经元进行聚类分析，确定了17种明确的f-type（图5a）。这些f-type在UMAP降维空间中形成了五个主要簇，分别对应于局部运动、ON响应、OFF响应、逼近刺激和运动光栅响应的神经元类别（图5b,c）。然后我们将每个经过HCR标记的功能记录区域（ROI）分配到这17种f-type之一，发现没有任何一种f-type仅限于某个特定t-type内高比例存在。另一方面，将HCR标记的功能ROI映射至UMAP空间则显示某些特定的t-type在功能超簇内局部富集（图5e）。

我们推测，同一t-type内部f-type的多样性可能起源于神经元细胞体位置的解剖学差异。为验证这一假设，我们将记录到的同一t-type内相同f-type的神经元组合为t/f簇，并分析其解剖分布。发现t/f簇通常沿前-后轴明显分离，例如f-type 4和9在**itpr1b+**神经元中几乎没有空间重叠（图5f）。通过核密度估计（KDE）测量t/f簇在空间上的重叠程度，我们确认真实数据的空间分离程度显著高于随机对照组（图5g）。由此证明视顶盖t-type内细胞体位置明显影响其功能表型。

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转录组与空间位置共同决定神经元形态

视顶盖（OT）神经元具有极其丰富的形态多样性，包括特定的树突分支及轴突投射靶区。为了探索转录组细胞类型（t-types）是否与不同的神经元形态类型相关，我们在表达atf5b、cort、itpr1b 和 sp5l 基因的转基因报告品系中，以稀疏标记的方法对单个神经元进行标记，并追踪其具体形态。结果显示，绝大多数表达cort的神经元是抑制性围脑室中间神经元（periventricular interneurons, PVINs），它们的细胞体位于围脑室层（stratum periventriculare, SPV）内。这些表达cort的中间神经元在树突分层模式上存在明显差异：其中两种类型的神经元单层分布于浅层灰质和纤维层（stratum griseum et fibrosum superficiale, SFGS），分别表现为较窄（PVIN 1a）和较宽（PVIN 1b）的分层结构；第三种类型则为双层分布，在中央灰质层与白质层（SGC/SAC）及SFGS两个不同层次内都有树突分布（PVIN 2）。此外，我们还观察到一种表达cort的神经元将轴突投射到背侧丘脑（dorsal thalamus）（图6a。表达itpr1b的神经元的细胞体则完全位于神经纤维层（neuropil）内（图6b）。这些神经元的突起通常表现出三层分布的形态结构，与成年鲤科鱼类中报道的视顶盖锥体型/Ⅰ型神经元（tectal pyramidal/type I neurons）十分相似，但在这一转基因品系中，我们也观察到了单层和双层分布的其他形态类型。

兴奋性转录组类型atf5b 和 sp5l 包含了特定的亚群，这些亚群分别表现为同侧或对侧投射的神经元以及树突分布多样的中间神经元（图6c,d）。总体上，我们发现，在同一转基因品系中观察到的单个神经元的投射模式及树突分布类型数量，远远超出了根据该标记基因的转录组聚类所预期的类型数量。这一规律不仅适用于我们研究的单个聚类标记基因（如cort、itpr1b），也适用于表达于多个转录簇中的基因（如atf5b、sp5l）。

我们进一步探讨是否能够依据转录组类型更细致地区分具有类似投射模式的神经元。对表达atf5b和sp5l神经元的共聚焦图像进行空间配准后，清楚地显示出二者在目标脑区中的差异（图6g,h）：表达sp5l的神经元在盖区的峡核（nucleus isthmi，一个被证明为GABA能的脑区）同侧投射形成轴突侧支，而表达atf5b的神经元则在峡核的谷氨酸能区域形成了同侧轴突侧支投射（图6h）。与t/f簇（转录类型与功能类型共同定义的细胞簇）类似，同一t-type的神经元形态在视顶盖内表现出明显的位置差异性：例如atf5b和sp5l神经元在视顶盖前部区域通常表现为中间神经元，而在视顶盖后部区域则多表现为长距离投射神经元（图6e,f）。综合以上发现，我们认为每种转录组定义的神经元类型（t-type）包含了一系列特定的形态和连接模式，这些模式在视顶盖的前-后轴方向上呈现明确的位置依赖性分布特征。

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 技术路线

1.单细胞RNA测序（scRNA-seq）：

对6–7日龄斑马鱼幼体的视顶盖进行大规模悬滴式单细胞RNA测序，鉴定出66种不同的神经元转录组类型，包括兴奋性和抑制性神经元亚群及其特异分子标记。

2.空间转录组分析（HCR 原位杂交）：

在完整视顶盖组织中应用多重RNA原位杂交链式反应（HCR）技术标记关键类型特异基因，并将其信号配准到标准脑图谱，以绘制各转录组细胞类型沿视顶盖三维轴线的空间分布。

3.双光子钙成像：

利用双光子显微镜对活体斑马鱼进行全脑容积成像，记录数千个视顶盖神经元对一系列视觉刺激的钙信号响应，刺激包括局部运动（运动点光标）、整体运动（运动光栅）、渐增/渐减光强和扩张逼近等行为相关视觉线索。

4.成像后 HCR 配准：

在功能成像实验结束后，对同一只实验鱼进行多轮 HCR 探针染色，检测多达6种互斥表达的标记基因，随后将钙成像获得的每个神经元ROI与其对应的转录组细胞类型进行匹配。通过成像数据与分子标记的配准，关联每个记录神经元的功能反应与其转录组身份。

5.转基因标记与稀疏形态追踪：

构建或选用驱动特定 marker 基因表达的转基因斑马鱼品系，选择目标转录组类型神经元采用稀疏示踪策略（随机低密度标记单细胞），并对单个神经元进行三维形态重构.该方法刻画了不同转录组类型在不同位置的树突和轴突形态特征，为功能类型与形态多样性的耦合分析提供支撑。

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 文章每个结果总结

单细胞转录组测序结果揭示了斑马鱼视顶盖神经元的高度多样性：共鉴定出66种转录组类型（t-types），涵盖33种兴奋性和33种抑制性神经元。每一种t-type均由特定的差异基因表达谱定义，一部分类型有独特的单基因标记，其余则可通过稀疏的标记基因组合明确辨识。这些转录组学定义的细胞类型在组织中并非随机分布，而是显示出分层的解剖排列：基于最近邻距离聚类分析，可将视顶盖室周带（SPV）中的细胞类型归为浅、中、深三个分子层。具体而言，最表层主要由谷氨酸能兴奋性神经元构成，最深层富含GABA能抑制性神经元，中间层则夹有胆碱能神经元。相同类型细胞在SPV中通常呈马赛克分布而很少紧邻聚集，体现出细胞类型在微观拓扑上的均匀镶嵌特征。 

进一步的空间转录组分析表明，转录组细胞类型沿视顶盖主要轴线呈现拓扑定位。研究选取多种只在单一或少数簇中表达的类型标记基因，利用多重HCR原位杂交测定了它们在视顶盖三维坐标中的分布。结果显示，不同t-type的细胞体在背-腹（浅-深）轴上富集于特定解剖层面，而在前-后轴上也存在系统性梯度。尤其是结合多个标记的共表达模式可以将转录组簇细分为位置不同的亚群：例如，在 atf5b 表达的神经元中，共表达转录因子 foxb1a 或 etv1 的亚群定位于SPV的不同深度层，而共表达 cebpa 的亚群则主要分布于SPV表层的后部区域；同样地，sp5l 阳性的神经元中，与 uts1 或胆碱能合成酶 chata 共表达的细胞局限于中间层，而与神经发生因子 neurod1 共表达的细胞则集中于后区。整体而言，由单一标记或组合标记界定的细胞群在背-腹轴上均表现出空间分离，而在前-后轴上的分布差异则与神经发生时序和后端边缘的新生区有关。这表明将转录组身份与空间坐标相结合，可以进一步细分细胞类型——基因表达极其相似的神经元在解剖位置上形成局部聚类，丰富了细胞类型的精细划分。

在功能层面，同一转录组类型的神经元在视觉反应选择性上出现分化。通过双光子钙成像记录大量神经元对多种视觉刺激的响应，研究发现属于同一 t-type 的细胞对刺激的调谐并不完全相同：每一种转录组类型内部都包含功能响应各异的子集。对钙信号响应模式进行无偏聚类，定义出17种功能类型（f-types），这些f-type可归并为对不同视觉特征敏感的五个类别，包括偏好局部运动、整体运动（光栅）、亮度增加（ON）或降低（OFF）、以及逼近looming刺激的群组。然而，功能类别与转录组类别并非一一对应：在将每个记录神经元的转录组身份与其功能归类相比较后发现，没有任何一种功能类型是某单一t-type独有或高度富集的，同时也没有任一转录组类型只对应单一功能反应。换言之，同源的转录组细胞类型内部包含多种功能调谐的神经元，而具有相似功能响应的神经元可以来源于不同的转录组类型。尽管如此，统计分析显示同一 t-type 内部的神经元在功能上仍比不同 t-type 之间更为相似，但这种相似性更多体现在局部 vs 全局运动偏好细胞比例上的差异，而非整个类型功能的统一。上述结果证实，即使在视顶盖这样具有视拓扑映射的脑区，转录组定义的类型与功能表型之间存在显著的多对多关系。

为解析转录组类型、空间位置和功能三者的关联，作者进一步比较了解剖位置与功能特征对细胞类型的预测作用。支持向量机分类分析显示，单凭神经元的解剖坐标就能比其功能响应模式更准确地预测其转录组类型归属。同时，将细胞空间位置与功能信息相结合并未显著提高预测准确率，这意味着空间位置本身已包含决定细胞类型的重要信息。功能分类分析也显示，每种转录组类型的神经元在功能空间中往往散布于多个簇，但特定转录组类型倾向于在某些功能“超簇”中局部富集，例如含 atf5b 基因的细胞更多地出现在偏好局部运动的功能簇附近。这些发现强调了视顶盖内存在基于解剖区域的功能特化：不同区域（如前 versus 后、浅 versus 深）的局部回路输入/输出差异，可能诱导了相同基因类型神经元在功能上的不同调整。换言之，细胞的组织位置是拓展其表型的重要外因，使得基因上相似的神经元在不同区域承担不同功能角色。

最后，研究在形态层面证实了转录组类型内部的形态多样性与位置密切相关。通过在多条转基因品系中稀疏标记单个神经元并重建形态，作者比较了若干转录组类型在不同位置的神经元形态差异。例如，对于 atf5b 型和 sp5l 型神经元，在视顶盖前部的位置往往发育为局部投射范围受限的中间神经元，而在后部的位置则倾向于发育为长程投射神经元。同一转录组类型的神经元还展示出多种树突/轴突分布形态（如单层、双层分布等），这些形态类别沿视顶盖的前后、背腹轴呈现分区排列的趋势。由此可见，外在的空间定位因素能够影响神经元的形态发生：基因表达高度相似的细胞在不同微环境中可塑造出截然不同的形态和联接模式，与其功能差异相呼应。这一系列结果从分子、功能到形态三个层面一致地证明：位置依赖的外部因素扩展了转录组近似神经元的表型范围，挑战了简单对应于基因类型的神经元分类观，揭示了发育和回路结构的区域特化对神经元多样性的深刻影响。

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 文章对我们研究的启发

1.神经元空间功能：

将该研究范式推广到其他拓扑映射的感觉运动通路中，进一步探索空间位置如何塑造神经元功能表型。例如，在哺乳动物上丘脑（视顶盖的同源结构）或初级感觉皮层中检验是否存在类似的位置依赖功能分化机制，以加深对神经元空间维度调控功能的认识。

2.跨物种发育比较：

比较不同物种中视顶盖/上丘脑回路的细胞类型拓扑组织和发育过程。在斑马鱼与哺乳动物间对比神经元类型的区域特化和时序产生机制，辨析哪些空间调控原则在进化上是保守的，从而揭示跨物种的神经发育拓扑规律。

3.形态功能耦合：

深入研究相同转录组类型因位置不同而产生形态和功能差异的分子基础。聚焦于区域特异性的信号通路，如生长因子梯度、轴突导向分子和局部网络活动，对形态与功能耦合的机制展开研究，以阐明外部环境如何通过基因-分子途径影响神经元表型塑造。

4.空间转录组技术：

在技术层面推动空间转录组学的扩展和应用。例如，开发更高通量、更高分辨率的原位分子检测手段，将转录组测序与空间信息深度融合；并将实时功能成像与空间基因表达图谱结合，用于更大尺度的脑组织，绘制全面的细胞类型-空间-功能三维图谱。

5.认知神经调控：

借鉴本研究对环境位置影响神经元表型的发现，探讨更高级脑区中认知功能的神经调控机制。例如研究在额叶皮层等区域，行为状态或感觉经验如何调节同一转录组类型神经元的功能输出，以及这种调节是否也体现空间拓扑上的模式，以理解认知过程中细胞类型功能的可塑性。

6.模型动物新用途：

利用斑马鱼这一模型所展示的多模态分析优势，将类似方法应用到其他模型动物和脑区。例如，将转录组-功能-形态联合分析用于研究与人类疾病相关的小鼠脑区，或应用于斑马鱼的学习、记忆回路，以开拓模型生物在系统神经科学研究中的新用途，帮助解析疾病状态下基因与表型的关系。

7.神经回路个体差异：

针对不同个体和条件，研究神经元拓扑功能布局的可变性。例如，考察遗传背景差异或不同感觉经验下，个体视顶盖细胞类型的空间分布和功能偏好如何改变。此方向的研究将揭示神经电路的个体化和可塑性原理，对理解大脑如何适应发育和环境变化以及个体间行为差异具有重要意义。