类器官相关实验protocol

（一）Organoid扩增与传代

（1）Organoid解离：当类器官长满后，吸去培养基。加入预冷的PBS，用巴氏吸管轻轻吹打，将类器官打碎，并收集到15ml离心管，至于冰上，每隔5min颠倒一次。大约15-20min，可观察到Gel融化。
（2）随后在预冷的离心机中离心：300 g， 3min，4 ℃离心，弃除上清。
（3）细胞消化：加入类器官专用酶进行消化，在37 ℃条件下消化10-20分钟，期间连续观测，将类器官消化成单个细胞，防止过度消化。
（4）加入DMEM完全培养基终止消化酶反应。再次以4 ℃、300 g的条件离心3 min，弃除上清。
（5）一般1：3传代，计算好Gel的体积，加入预冷的Gel，滴入24孔板，放置37度，1-2h后加完全培养基。

（二）Organoid慢病毒感染

（1）单细胞制备：将Organoid消化为单细胞悬液。
（2）慢病毒感染：用上述构建好的慢病毒对类器官进行感染，1ml病毒+1ml培养基，感染14个小时后，以300 g，3 min，4 ℃离心。
（3）重悬与种植：用Matrigel胶重悬感染后的细胞。接种于24孔板，每孔50 μL。
（4）培养基更换：前3天使用Isolation培养基，感染后3天改为含嘌呤霉素的Expansion培养基。
（5）感染效率判断：观察GFP荧光，评估感染效率。
（6）后续检测：收集足够数量的类器官用于WB检测，分析目标基因表达水平。

（三）Organoid 琼脂糖包埋

（1）样本转移：将类器官从Matrigel胶中释放，使用预冷的4%多聚甲醛化胶。剪去1mL枪头尖端以避免机械损伤，将类器官转移至15 mL离心管中，冰上静置至少20min。
（2）清洗：以1500 rpm，3 min，4 ℃离心去除甲醛，冰PBS吹打清洗2次。
（3）固定过夜：甲醛溶液固定4℃过夜。
（4）琼脂糖模具制作：用无菌PBS溶解琼脂糖浓度为3%，微波炉高火融化后，向1.5 mL EP管中加入600 μL琼脂糖，然后再向其中插入一小的500 μL PCR管，使中间形成一个圆底凹槽，冰上放置，凝固后取出小EP管。
（5）包埋：吸取类器官沉淀置于凹槽底部，尽量包埋在中间位置，加入PBS至高于琼脂糖槽的边缘。离心后去除PBS，加入琼脂糖填满，凝固后取出，行常规脱水、石蜡包埋步骤。