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杂志：Molecular Biomedicine

影响因子：6.2

研究概述：子宫内膜癌（UCEC）是女性三大恶性肿瘤之一，HOX基因是真核生物中的一个高度保守的DNA序列家族，该家族成员在多种类型细胞中的表达机制以及在UCEC中肿瘤微环境细胞浸润的发展和进展中的潜在作用尚不清楚，作者利用TCGA和ICGC数据库，分析了39个HOX基因转录组表达情况与临床特征或生物学特征/通路之间的关联，发现HOX 基因是UCEC发展进展以及肿瘤微环境多样性和复杂性形成的关键因素。在该研究中，作者发现，低 HOX 评分组患者具有丰富的抗肿瘤免疫细胞浸润，肿瘤分化良好，预后较好。相比之下，高HOX评分与免疫检查点的阻断相关。RT-qPCR和免疫组化检测发现在肿瘤患者中HOX表现出较高的基因表达。上皮细胞中 HOX 基因的显着上调可激活与肿瘤侵袭和转移相关的信号通路，例如核苷酸代谢过程等。最后，通过 HOX 评分与癌症相关成纤维细胞 （CAF）之间的正相关性，作者建立了用于预测患者的预后结局的风险预后模型。综上所述，HOX 基因可作为 UCEC 诊断和预测的潜在生物标志物，并开发更有效的治疗策略。
研究结果：

鉴定与HOX基因相关的DEG和调节方式

作者从无病区间（DFI）,疾病特异性生存期（DSS）, 总生存期（OS）, 和无进展生存期（PFS）四个方面检测了HOX基因在泛癌中的影响，其中有28个不同的HOX基因表达与UCEC中的UCEC 中 DFI、DSS、OS 和 PFS 的显著差异相关，不同 HOX 基因之间对肿瘤分级的调控存在差异。作者还检测了HOX基因在肿瘤中的突变频率，拷贝数变异 （CNV） 和表达状态（补充图）。在基因表达水平上，肿瘤组和正常组 HOX 基因的表达水平存在明显差异（图1a），且HOX基因之间也存在极显著的正相关性。以HOX基因的表达情况进行无监督聚类和PCA分析， UCEC患者可划分为三类，分别为HOX clusters A, B, and C （图1b），其中HOX clusters A表现出显著的生存优势（图1c）,而HOX clusters C中，更高级别分期和死亡结局的患者比例显著较高。GSVA分析显示，HOX clusters C中有一些通路的表达高于 HOX clusters A，包括与 DNA 复制、细胞周期、P53 信号传导、碱基切除修复、同源重组和错配修复相关的通路（图1d）。簇与簇之间的差异基因结果显示，三个簇之间的共有DEGs有12个（图1e），基于这12个DEG进行再次的无监督聚类和PCA，患者被分为为两组不同的基因组亚型，为基因簇A和B，其中基因簇A表现出显著的生存优势（图1f）。热图显示两个基因簇之间 HOX 簇相关 DEGs 存在显著差异：大多数 HOX 簇相关 DEGs 在基因簇 B 中表现出低表达状态，而 HOX clusters C患者主要集中在基因簇 B 中（图 1g）。

利用UCEC中HOX基因所介导的表达模式构建新的风险评分模型

作者比较了HOX基因各自在基因簇间的表达情况（图2a），为了研究 HOX 基因在 UCEC 中的具体调控功能，作者对 12 个 HOX 簇相关 DEGs 进行了 GO 富集分析。GO 富集分析表明，HOX 相关基因富集于多种途径，即 DNA 结合转录抑制活性、DNA 结合转录激活因子活性、RNA 聚合酶 II 特异性和转录调节复合物 （图2b）。随后作者基于这些基因， 作者利用单变量Cox回归和PCA构建了一套评分模型，以量化UCEC个体患者的HOX基因基因表达，并预测UCEC患者的治疗反应和预后。基于HOX评分，作者将患者分为高、低评分两组， 生存曲线结果显示，HOX 评分低的患者生存率明显高于 HOX 评分高的患者（图 2c）。作者还观察了HOX评分与相关临床特征（如年龄、肿瘤分级和生存率）的关系，其中G3 组患者的 HOX 评分显著高于 G1 和 G2 组（图2d），死亡组的HOX评分也明显高于存活组（图2e）。在HOX评分与浸润免疫细胞的相关性结果中，HOX 评分与活化的树突状细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、浆细胞样树突状细胞和 T 滤泡辅助细胞的数量呈负相关，与活化的 CD 4 细胞和 2 型 T 辅助细胞呈正相关（图2f）。低 HOX评分组通常具有较高的免疫细胞表达，包括 B 细胞、CD8+ T 细胞、溶细胞活性、人白细胞抗原 （HLA）、未成熟树突状细胞 （iDC）、炎症促进细胞、自然杀伤 （NK） 细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、T 细胞共刺激、T 辅助细胞、T 辅助性 1/T 辅助性 2 细胞和 I/II 型干扰素 （IFN） 反应(图2g)。

HOX评分在预测肿瘤突变中的作用

为了了解肿瘤中HOX基因的突变状态，作者将患者分为 L-TMB 和 H-TMB 两类。Kaplan-Meier 曲线显示 H-TMB 患者的总生存期更长(图3a), 当将TMB与HOX评分结合起来时，研究发现高 HOX 评分和高 TMB 的患者都显示出显著的生存优势（图3b），并且HOX评分与TMB之间存在着正相关性（R= 0.3,图3c）。高HOX评分组中与 TMB 相关的基因突变率更高（图3d-f）。在肿瘤微卫星不稳定性（MSI）方面，高HOX评分组 MSI-H 比例几乎是低 HOX评分组的两倍，而免疫细胞比例评分在不同HOX分组中没有差异(补充图)，以上结果表明，HOX 可促进肿瘤细胞中的基因突变并加剧肿瘤 MSI;因此，HOX 评分高组的患者似乎更能产生对免疫治疗敏感的新抗原。

HOX评分在免疫治疗和化疗效果中的作用

接下来，作者探讨了免疫检查点与高低HOX评分组之间的关系。高HOX评分组中 CD44、CD27、CD86、CTLA4、TIGIT 等大多数免疫检查点表现出较低的表达状态（图4a）, spearman相关性分析表明，与 HOX 评分负相关性最强的检查点是 CD244 、 CD96 和 TIGIT（图4b）。为了探讨HOX评分与TME中免疫细胞和基质细胞比例之间的相关性， 作者进一步检查了两个HOX评分组之间的差异，低分组的 ESTIMATE 、免疫和基质评分高于高分组，而低分组的肿瘤纯度较低（补充图）。因此，与 HOX 评分高的 UCEC 患者相比，HOX 评分低的患者肿瘤免疫和基质成分更丰富。为了验证HOX 评分与抗癌药物反应的关系，作者使用肿瘤免疫功能障碍和排除（TIDE）根据治疗前的肿瘤特征预测 ICI 的治疗效果。低 HOX 评分组的 TIDE 评分显著高于高 HOX 评分组（图4c），并且TIDE 评分高的患者明显优于 TIDE 评分低的患者预后（图4d）。当结合TIDE和HOX评分用于确定患者的总生存期时，作者发现高 TIDE 和低 HOX 评分组合的患者表现出显著的预后优势;低 TIDE 和高 HOX 评分的患者预后最差（图4e）。H-dysfunction评分高的组预后较好（图4f），且H-dysfunction 和低HOX评分组合时具有最好的预后结局（图4g）。总的来说，无论 TIDE 和dysfunction评分如何，低 HOX 评分组的患者始终比高 HOX 评分组患者生存率更高，表明 HOX 评分在预测 ICI 治疗效果方面的价值。作者还比较了不同 HOX 评分组之间环帕胺（图4h）、福替尼（图4i）、非德拉替尼和帕唑帕尼 4 种抗肿瘤药物的半数最大抑制浓度 （IC50） 差异;发现HOX低分组的 IC50 高于高分组，IC50 值与 HOX 评分之间呈负相关(图4j-k), 以上说明HOX 评分高的 UCEC 患者对抗肿瘤药物有更好的治疗反应。

HOX基因在临床组织样本单细胞测序数据结果中的表达情况。

作者对收集的UCEC及其配对的正常组织样本进行scRNA-seq分析， 聚类分析结果显示，组织内主要由六种细胞组成（图5a），HOXA 3、HOXA 4、HOXA 7、HOXA 9 和 HOXA 10在上皮细胞中显示出高表达水平，且这几个基因在不同细胞中的表达差异最显著（图5b）。UMAP 散点图显示，在上皮细胞中，HOXA 3、HOXA 4、HOXA 7、HOXA 9 和 HOXA 10 在肿瘤组织中的表达更多（图5c-f）。对上皮细胞中 HOX 基因的和基因表达差异的进一步分析表明，与正常组织相比，HOX 评分、HOXA 3、HOXA 4和HOXA 10均在肿瘤组织中的表现都显著升高（图 5g-j）。随后，作者分析了四个基因与GO-BP途径的相关性（图5k-n）。

HOX基因对UCEC中成纤维细胞的影响及预后模型构建

通过 scRNA-seq 技术检查正常子宫内膜组织和肿瘤组织中的成纤维细胞，发现肿瘤组织中的 HOX 评分高于正常组（图6a），COL1A2 基因作为成纤维细胞的标记基因，在肿瘤组织中表达更高（图6b），且与HOX评分呈正相关（补充图）。接下来，作者将来自TCGA数据的样本分为高 CAF 评分组和低 CAF 评分组，发现高CAF评分组的患者生存率明显高于低评分组(图6c)。WGCNA共表达分析鉴定与CAF相关的关键模块， 其中棕色模块与CAFs的正相关度（图6d）。将棕色模块基因与HOX相关基因取交集后（图6e），进行富集分析，发现交集基因参与了如血管生成、PID 整合素 1 通路等多种过程，KEGG分析显示，这些基因参与细胞底物粘附的负调控（图6f）。接着，根据Cox分析结果，作者筛选了44个交集基因中的7个，发现他们与子宫内膜癌患者的OS显著相关，并利用LASSO回归建立了风险评分模型，进一步筛选到6个关键基因。该模型的AUC值为0.699（图6g）。

实验检测子宫内膜肿瘤组织中HOX基因的表达情况

作者收集了18例UCEC患者的癌组织和癌旁组织以及3例健康个体。H&E 染色显示肿瘤组织中细胞数量增加、排列无序和有丝分裂象增加，这与 UCEC 的诊断一致。RT-qPCR结果显示，在癌旁组织中，HOXB5、HOXB7、HOXB9 和 HOXB13 基因的表达普遍高于正常子宫内膜组织中的表达（图7a-d）。UCEC 癌组织中 HOXB8、HOXB9 和 HOXB13 基因的表达普遍高于正常组织（图7e-g），其中，HOXB8 在肿瘤组织中的表达比癌旁组织高约 20 倍（图7h）。IHC结果显示，与正常组织相比，HOXA 3、HOXA 4、HOXA 7、HOXA 9 和 HOXA 10 在肿瘤组织的细胞质和细胞核上表现出更强的表达（图7i-l）。在肿瘤组织中，HOX 基因阳性的百分比贡献高于正常组（图m-p）。这些结果表明HOX 表达水平从正常组织到肿瘤组织逐渐升高，进一步验证了 HOX 可以作为促致癌基因调节 UCEC 的发生和发展。

研究总结：

在该研究中，作者分析了所有HOX基因与UCEC的相关性，然后利用无监督聚类和主成分分析构建HOX评分，并将其与临床特征和多种生物成分和途径相关联，以明确HOX评分与UCEC之间的正相关，此外作者利用单细胞测序数据，发现了HOX表达较高的上皮细胞和成纤维细胞。接下来其比较了正常组织和肿瘤组织之间上皮细胞内 HOX 的差异表达，并探讨了 HOX 基因与上皮细胞内信号通路之间的潜在关系。此外，作者还比较了正常组织和肿瘤组织之间 CAFs +HOX 评分的差异，探讨了 HOX 评分与 CAFs 的相关性，并建立了基于 HOX 基因与 CAFs 之间相互作用的风险预后模型。作者发现 HOX 基因可以调节 CAFs 中的一些肿瘤相关信号通路。最后，该研究通过收集了 36 份样本并使用 RT-qPCR 和 IHC 检测这些标本中 HOX 基因的表达。