如何制备生物素标记的RNA探针？

生物素标记RNA探针制备实验流程：

1.自行准备，带 T7 启动子序列的线性化探针模板质粒、PCR 产物或者合成的模板 DNA 片段。

2.将试剂盒中各组分取出，BIOG T7 RNA Polymerase 、RNA Protector、Biolabelling Mix 置于 2-8℃冰箱解冻，其余成分放置于室温融化，各组份解冻后 3000rpm 离心 30 s。

3. 按下表顺序依次加入反应组分：

*注意加样顺序，请预先计算好体积，严格按照以下顺序加入各反应组份:水→Buffer→Biolabel Mix→RNA Protector→DTT→酶→DNA模板，模板和酶一定要最后加入。

*模板加入量最好在 0.5-1μg 之间，如模板量确实较少，可低于 0.5μg。

4.用移液器轻轻混匀各组分，并短暂离心收集，37℃孵育 2 h。如合成小于 0.2kb RNA，可将反应延长至 4 h。

5.本试剂合成的 RNA 探针一般不需要再纯化，如需纯化，建议采用乙醇沉淀法进行纯化，具体操作可参考分子克隆等工具书。

6.如欲检查 RNA 探针的标记效果，可按下表分别配制反应液，按本说明书上述方法分别进行 RNA 合成：

表1质控 DNA 模板未标记 RNA 合成

表2质控 DNA 模板标记 RNA 合成

反应结束后，分别取1ul反应液进行变性琼脂糖凝胶电泳(1.5%),如发现标记 RNA 的电泳条带略后于未标记 RNA，则表明标记成功。也可取2ul 标记 RNA，点样于带有正电荷的尼龙膜，进行斑点免疫检测，详见分子克隆等工具书。