miRNA的提取、逆转录及实时荧光定量PCR技术研究

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度约为19-25个核苷酸的内源性非编码单链 RNA 分子，在进化上具有高度保守性。其通过转录后调控机制参与基因表达调控，广泛涉及细胞增殖、分化、凋亡及新陈代谢等关键生物学过程，成为当前生命科学领域的研究焦点。准确、特异的 miRNA 检测与定量分析是开展相关研究的核心环节，其中荧光定量 PCR 技术因其高灵敏度和特异性，成为目前应用最为广泛的检测手段。然而，由于miRNA分子自身的特殊性，传统的 RNA 提取、逆转录及PCR方法难以适用，需采用针对性的技术策略。本文将系统阐述miRNA提取、逆转录及实时荧光定量PCR（qPCR）的关键技术要点。

一、miRNA的提取技术

miRNA的提取面临分子质量小、丰度低的技术挑战。传统TRIzol 试剂及常规RNA提取试剂盒主要针对大分子RNA（如rRNA、mRNA）进行优化，对miRNA的捕获效率显著不足，其核心原因在于小分子核酸难以通过醇沉淀或核酸纯化膜/磁珠吸附实现有效回收。

为解决这一问题，miRNA富集技术被证实为高效解决方案。该技术通过专用富集试剂促使低丰度小分子miRNA聚集形成复合体，显著增强其与核酸纯化柱的吸附能力，从而大幅提高提取效率。目前，Qiagen、BIOG等公司的 miRNA 富集提取试剂在实践中表现出较好的效果，其技术原理在于先使用富集试剂将含量较低、分子量较小的miRNA聚集在一起，为后续纯化步骤提供更易捕获的靶向分子。

二、miRNA的逆转录技术

miRNA逆转录的核心难点在于其短链结构导致的引物结合效率低下，因此需通过分子改造延长miRNA序列以适配逆转录反应，主要有两种技术路线：

（一）Poly (A)加尾法

该方法通过Poly (A)聚合酶在 miRNA 的 3' 端添加 Poly (A) 尾，延长后的序列可与 Oligo (dT) 引物结合。其技术关键在于：

Poly (A)聚合酶活性：高活性酶可在短时间内催化形成较长的Poly (A)尾，为引物结合提供充足位点；

Oligo (dT)引物设计：需引入锚定碱基以避免单纯Oligo (dT)与 miRNA 结合时的错位现象，显著提升逆转录特异性与效率。

该方法的优势在于单次逆转录产物可用于多个miRNA的qPCR 检测（适用于3个以上miRNA的研究），减少实验操作步骤。目前 Thermo、Taraka、BIOG 等公司的加尾法逆转录试剂应用广泛，其核心技术壁垒在于高效 Poly (A) 聚合酶的制备与纯化。

（二）茎环法

通过设计特异性茎环结构引物与miRNA的3'端结合，实现序列延长。茎环结构的设计需满足双重要求：

·高效特异性识别miRNA的3'端序列；

·具备良好的折叠-解折叠动态平衡，确保逆转录酶顺利延伸。

该方法的优势在于逆转录产物特异性高，适用于1-2个miRNA 的精准检测。国内多数试剂厂商提供茎环法逆转录试剂盒，其技术难点在于茎环引物的热力学稳定性优化。

三、miRNA的qPCR技术

miRNA qPCR的成功依赖于前期提取与逆转录的质量控制，其技术要点包括：

1、试剂兼容性：逆转录试剂与qPCR试剂的配套使用至关重要。由于逆转录引物中通常包含qPCR引物的结合序列，不同厂商试剂的引物设计存在差异，混用可能导致扩增效率下降或非特异性产物生成。

2、引物设计：miRNA上游引物的设计需兼顾序列特异性与扩增效率，对初学者而言存在较高技术门槛。建议优先选择提供配套上游引物的试剂厂商，以降低实验优化难度。

3、反应体系优化：需根据模板浓度、引物Tm值等参数调整退火温度与循环数，确保扩增曲线符合定量标准（如Ct值在15-35范围内，熔解曲线单一）。

综上所述，miRNA的检测流程需针对其分子特性进行全流程优化：提取阶段通过富集技术提高回收率，逆转录阶段根据研究需求选择Poly (A)加尾法（多靶点）或茎环法（高特异性），qPCR阶段注重试剂配套性与反应条件优化，从而实现miRNA的精准定量分析。