文献学习133–Trimethylamine N-Oxide Binds and Activates PERK to Promote Metabolic Dysfunction

1. FMO3 Induces FoxO1 via Its Product, TMAO

FMO3在体内的作用机制复杂，难以进行机制研究。因此作者使用了FoxO1蛋白作为FMO3活化的标志。理由：(1) epistasis experiments showed it to be a biologically important target of FMO3, and (2) the effects of FMO3 on FoxO1 were cell autonomous.
作者首先探究了FMO3（催化TMA生成TMAO）活化FoxO1是否依赖于其酶活性。所以作者使用了腺病毒包装了WT-FMO3和P153L FMO3突变体，并转染了AML12肝细胞。结果显示突变了FMO3磷酸化位点阻断了FMO3诱导的FoxO1表达(a)。提示FMO3可以生成诱导FoxO1生成的产物或者清除可以抑制FoxO1的物质。（TMAO对FoxO1的表达有促进作用或TMA对FoxO1的表达有抑制作用。）因此作者分离了Fmo3^+/+和 Fmo3^-/- 小鼠的肝细胞，使用TMA和TMAO干预。结果显示(1)没有干预的条件下，FoxO1在Fmo3^-/- 肝细胞表达量比Fmo3^+/+更低；(2)TMA可以在Fmo3^+/+而不是Fmo3^-/- 细胞中诱导FoxO1的表达；(3) TMAO在Fmo3^+/+和Fmo3^-/- 细胞中均可诱导FoxO1的表达 (b)。在小鼠实验中也得到了类似的结果，作者对Fmo3^-/- 和Fmo3^+/+小鼠给予TMAO或者TMA前体choline喂养6h，给予TMAO喂养的Fmo3^-/- 和Fmo3^+/+小鼠FoxO1水平相当，而choline喂养的小鼠，FoxO1水平在Fmo3^-/-肝脏更低(c)。
肝脏特异性FoxO1敲除小鼠FoxO1 L-KO小鼠给予TMAO喂养升高了FoxO1蛋白水平(d)，糖异生的基因G6PC和PCK1也升高(e-g)。糖耐受和 pyruvate tolerance testing (PTT) 实验中葡萄糖水平仅在FoxO1 flox鼠升高(h-l)。

FOXO1，即叉头框蛋白O1，它是一种在多种细胞类型中表达的转录因子。FOXO1主要通过响应细胞内外的信号，如PI3K/AKT信号通路的激活，来调节细胞的增殖、凋亡、代谢和应激反应等生命活动。其作用机制涉及到FOXO1蛋白的磷酸化、乙酰化等翻译后修饰，这些修饰影响其在细胞核与细胞质间的穿梭，进而调控其靶基因的表达。FOXO1参与的主要信号通路包括PI3K/AKT、Wnt/β-catenin、JAK/STAT等，这些通路在细胞生理过程中发挥着关键作用。在生物学意义上，FOXO1对维持细胞稳态、调节免疫反应、影响肿瘤发生发展等具有重要作用，其活性的异常可能导致多种疾病的发生，包括糖尿病、心血管疾病和肿瘤等。

2. TMAO Selectively Activates the PERK Branch of the Unfolded Protein Response

为了寻找TMAO的直接靶点，作者对50 mM TMAO/对照干预的大鼠肝细胞进行了microarray analysis(a, b)，发现TMAO诱导的通路主要富集到内质网应激相关通路(a)，同样的许多被TMAO诱导的转录本与内质网应激反应相关，包括Hspa4、Chop和Herpud1 (b)。WB实验显示TMAO增加了p-PERK, p-eIF2a 和ATF4靶基因和CHOP的表达(c)，而Xbp1 splicing和cleaved ATF6水平没有显著变化(c, d)。而ER stress的经典诱导剂thapsigargin可以显著增加Xbp1 splicing和cleaved ATF6水平，并增加p-PERK, p-eIF2a, 和 CHOP 水平(c)。相反，Fmo3敲低降低了p-PERK, p-eIF2a 和 ATF4 而不是cleaved ATF6水平(e)，但Xbp1 splicing显著升高了(f)。
发现TMAO可以引起PERK表达是意料之外。此前报道中TMAO可以作为分子伴侣并抑制ER strss。然而本实验与此前报道的实验有两个关键不同。本次实验使用的TMAO是生理剂量(50 uM)，而此前文献中使用的是药物浓度(0.1 to 2 M)。其次此前的培养实验是在ER stressors存在的条件下。因此作者比较了药物浓度(300 mM)的TMAO和生理剂量(50 uM)，发现在thapsigargin存在的条件下300mM的TMAO降低了p-PERK 和 Xbp1 splicing，而50um的TMAO则没有显著作用(h, i)。类似的，敲除Fmo3降低内源性的TMAO在palmitate 或 thapsigargin 存在的情况下也引起了p-PERK 和 p-eIF2a的下降(附图)。Thus, TMAO only reduced ER stress at pharmacological concentrations.

3. TMAO Binds Directly to PERK

由于PERK已知的上游主要是未折叠蛋白，但是似乎TMAO活化PERK不太可能引起异常的蛋白折叠。首先TMAO并不影响蛋白翻译，也并不激活ATF6和IRE1/XBP1s，而且TMAO对PERK的诱导作用十分迅速，在干预15min即可检测到，因此作者推测TMAO可以直接激活PERK。
IP结果显示³H-TMAO可以直接与PERK结合(a)。使用免疫亲和纯化的PERK进行competitive binding assays结果显示³H-TMAO对PERKE的结合可以effectively competed by micromolar concentrations of unlabeled TMAO (b).
PERK包含了位于内质网中的lumenal domain (LD)、跨膜结构域、包含了其酶活性位点的 cytosolic domain (CD)(c)。使用截短突变，作者发现³H-TMAO结合于LD区(附图)。类似的，³H-TMAO可以结合于bacterially expressed fusion protein encoding the PERK LD而不是PERK CD(c)。此外，competitive binding assays using the lumenal-domain-containing fusion protein mirrored those using immunoaffinity-purified PERK, with micromolar concentrations of unlabeled TMAO able to dissociate ³H-TMAO(d)。

4. PERK Is Required for the Induction of FoxO1 by TMAO

此前文献报道，PERK可以诱导FoxO1在丝氨酸298位点的磷酸化，因此作者推测FMO3和TMAO对FoxO1的作用是由PERK介导。为了验证这个假设，作者从PERK^flox/flox鼠分离了原代肝细胞，给予腺病毒包装的GFP对照或Cre重组酶，在缺乏PERK的条件下，TMAO对p-eIF2a的诱导作用消失(e)。体内试验同样显示给予小鼠PERK抑制剂GSK2656157可以降低TMAO诱导的FOXO1蛋白表达，并恶化葡萄糖耐受情况(f, g)。在肝脏特异性PERK敲除鼠中也得到了一致的结果(h, i)。

5. TMA-Producing Microbes in the Gut Activate PERK

6. FMO3 Inhibition Reduces PERK Activation and Insulin Resistance In Vivo

前述结果显示降低TMAO可以改善代谢而不提高ER stress，与此一致的是，胰岛素抵抗小鼠敲除了Fmo3后显示出降低的p-PERK，而不影响cleaved ATF6或XBP1 splicing。并因为其可抑制Foxo1，gluconeogenic基因表达同样下降，糖耐量得到改善，血脂水平也下降(附图)。
此前文献报道，完全阻断FMO3会引起TMA堆积，并导致恶臭。而降低FMO3活性至非糖尿病水平则会在带来有益效应的同时并不引起odor。因此作者并没有选取FMO3抑制剂，而是使用了phytochemical 3,30
-diindolylmethane (DIM) (which is derived from cruciferous vegetables and better known for its anti-neoplastic effects, can inhibit FMO3 activity). 结果显示DIM降低了肝脏TMAO但并不影响肝脏胆碱、甜菜碱、或肠道菌群产生的TMA水平(a-c)。而且其显著降低了肝脏p-PERK，Foxo1和gluconeogenic 基因表达，改善了葡萄糖耐受，降低了血浆胰岛素水平(d-i)。此外，DIM并不影响体重、食物摄入或血浆/肝 lipids (附图)。