顶刊分享–克罗恩病瘘管由特异性成纤维细胞生态位界定

作者，Evil Genius

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今天我们分享文献

知识积累

瘘管型克罗恩病（CD）是炎症性肠病（IBD）中致残率较高的亚型，约30%的IBD患者会发生此种病变。

采用空间转录组学（ST）、全谱系单细胞RNA测序、多重免疫荧光及定量胶原蛋白成像技术，对92例不同来源的肠道瘘管及对照组织进行整合分析，构建了空间分辨表达图谱。

结果1、瘘管型克罗恩病的空间图谱构建

单细胞RNA测序（scRNA-seq）与空间转录组学（Visium ST、Xenium ST）分析。

细胞类型的注释与单细胞空间数据的匹配。

克罗恩病瘘管中的成纤维细胞程序

通过免疫组化检测TWIST1表达，并对84例患者样本进行TWIST1多重定量PCR（qPCR）分析，结果显示TWIST1在瘘管病变中显著上调。

肠道成纤维细胞的Meta-analysis

对报告炎症相关成纤维细胞状态的IBD scRNA-seq数据集进行了Meta-analysis，非负矩阵分解（cNMF）识别出8个IBD相关基因程序，涉及干扰素应答、滤泡相关功能、ECM沉积重塑及伤口愈合等通路。FAS细胞代表了一种肠道伤口愈合群体，其核心促修复基因网络在多个器官系统中具有保守性。

CD瘘管的层状空间分区

对CD与非CD患者瘘管区域的病理学家指导感兴趣区（ROI）进行了亚细胞空间分析。

在原位检测队列中，靶向Xenium检测板鉴定出约60个细胞类型cluster，包含11个成纤维细胞subcluster以及scRNA-seq中通常代表性不足的中性粒细胞和神经元。

通过差异丰度分析确定细胞cluster与不同瘘管表型的对应关系，发现在所有瘘管类型中多个细胞群体持续富集，而瘘管亚型特异性变异较少。值得注意的是，当控制位置与上皮化状态后，即使来源于憩室病的对照瘘管也呈现类似变化，提示已形成瘘管的分子病理学存在共性，与病因无关。还检测到与已知肠道多样性一致的区域特异性变异。在成纤维细胞中，五个细胞cluster在所有瘘管中持续过表达：其中三个与FAS细胞最匹配，两个类似滤泡网状细胞（基质4）和粘膜下成纤维细胞亚群。FAS亚簇通过表达不同的转录因子、细胞因子、趋化因子、形态发生素和ECM因子来区分。

空间图谱显示FAS细胞沿瘘管呈离散层状排列。FAS-LAZ（病变相邻区）细胞与增殖性FAS-CC（细胞周期）细胞衬于管腔表面，表达形态发生素（WNT5A和DLL1）及IL11。其下方，FAS-ALC（活动病变核心）细胞形成较厚的病变核心，纤维化性FAS-FOZ（纤维化外层）细胞位于基质更深处。随着与管腔距离增加，免疫信号与重塑通路逐渐减弱。类滤泡成纤维细胞的FAS-LOC（淋巴组织形成）细胞散布于整个病变区域，与T细胞和B细胞浸润相关——这与健康组织中此类细胞仅限于滤泡的情况不同。在瘘管中，这些细胞在基质中的弥漫分布提示正常组织结构破坏，可能促进免疫失调与慢性炎症。

通过计算每个细胞与瘘管边缘的距离及分析基因表达梯度，量化空间变异模式。这些模式在各类瘘管中保持一致，证实了FAS亚群的分区现象。空间相关性分析凸显了FAS程序与免疫、ECM基因的关联：PRRX1与介导MMP抑制的TIMP基因共定位，WNT5A和CXCL13与增殖标记物和淋巴细胞标记物共定位，NRG1和F3在瘘管边缘与上皮细胞共定位。中性粒细胞和巨噬细胞与CXCL1和CXCL2共定位，反映主动招募和天然免疫应答。这些数据共同揭示了FAS细胞如何根据局部组织微环境的细微变化调整其表型。

通过共享最近空间邻域法将scRNA-seq数据映射至Xenium组织切片，确认了先前检测到的定位特征，FAS细胞直接定位于瘘管边缘。scRNA-seq数据映射还揭示了未包含在原位检测panel中的基因分区规律。分析了ECM相关基因表达模式——由于多数胶原基因家族成员丰度高且存在光学 crowding 效应，原位检测难度大。定位在FAS-ALC与FAS-FOZ过渡区的细胞显示I型和III型胶原诱导表达，LOX（胶原交联酶）升高，TIMP3（MMP抑制剂）缺失，PLOD1（交联前纤维水解酶）、POSTN（促进成纤维细胞活化与招募）、CNN2（促进增殖与胶原合成）和SERPINE1（纤溶酶原激活物抑制剂）表达增加。位于FAS-FOZ深层的细胞也高表达I型和III型胶原，而FAS-ALC细胞不表达任何I/III型胶原，特异性表达常与伤口愈合相关的COL7A1。这种FAS细胞状态相关的分子分区支持其功能分工：表层区域主导活动性重塑，深层区域主导促纤维化功能。

在蛋白水平，多重免疫荧光验证了上述发现。FAS-LAZ细胞高表达F3，细胞外F3仅限于沿瘘管边缘沉积的薄层区，形成符合松弛或未成熟ECM特征的无序波状纤维形态；POSTN沉积则见于核心病变外部的斑块区。典型用于上皮-基质连接处锚定纤维的COL7，在我们的数据中于非上皮化瘘管边缘（缺乏基底膜）强表达，提示COL7可能标记试图发生但紊乱的上皮化过程——该解读属推测性，需在本研究之外进行功能验证。

CD瘘管中的免疫-基质微环境

空间数据集实现了对瘘管免疫细胞行为的可视化。富含中性粒细胞和巨噬细胞的区域衬于非上皮化表面，对应浅表肉芽组织，以产生趋化因子（CXCL5、CCL3、CCL4和CXCL2）的SPP1+巨噬细胞为主，通过前馈机制招募中性粒细胞和巨噬细胞。在相邻的FAS-LAZ和FAS-ALC富集层内，MMP9+巨噬细胞同时展现重塑与免疫调节功能（LYZ、IDO1、C1QA/B、MRC1和STAT1），另一细胞簇则表达T细胞招募趋化因子（CXCL9、CXCL10和CXCL11）。后者与CD8+、CD4+、调节性T细胞、树突状细胞及B细胞共定位，偶尔与FAS-LOC成纤维细胞形成类滤泡聚集体，提示免疫应答从病变表面向更广泛的适应性免疫反应扩展。更远端的FAS-FOZ富集区免疫浸润减少，但存在增殖的内皮细胞和周细胞，符合血管生成特征。

空间细胞间信号分析突出了瘘管病变中的细胞因子-趋化因子网络、血管生成、ECM重塑、粘附-迁移及生长通路（FGF、PDGF和WNT）。这些反映了强烈的巨噬细胞-成纤维细胞交互作用，包括ECM更新中的LRP1–MMP9或SERPINE1、纤维化中的整合素–TGFB1或SPP1、促进增殖的PDGFRB以及成纤维细胞活化中的SPP1–CD44。

我们来总结一下

发现核心细胞：瘘管相关基质（FAS）成纤维细胞

研究首次识别并命名了一类特殊的成纤维细胞——FAS细胞。

这群细胞是驱动瘘管形成和持续存在的关键细胞，它们表达与纤维化、组织重塑和炎症相关的独特基因特征。

揭示空间组织结构：瘘管具有分层的“微观解剖”结构

FAS细胞并非杂乱分布，而是围绕瘘管管道形成高度有序的同心圆层状结构：

内层（LAZ）： 邻近管腔，细胞活跃增殖，表达形态发生素。

核心层（ALC）： 为病变主体，细胞高度活跃。

外层（FOZ）： 处于相对静止状态，主导致密的胶原沉积和纤维化。

这种“分子分区” 表明，瘘管的不同区域执行着从活跃重塑到慢性纤维化的不同功能。

阐明致病机制：多细胞协同破坏正常愈合过程

异常的上皮化： 在缺乏正常基底膜的区域，出现了COL7A1等异常的上皮化标记，提示愈合过程紊乱。

活跃的免疫-基质互作： 特定的巨噬细胞亚群与FAS细胞通过复杂的信号网络（如SPP1-CD44, WNT-PCP通路）进行“对话”，共同促进了瘘管的侵袭性生长和慢性炎症。

发育通路的重新激活： FAS细胞高表达 TWIST1, PRRX1 等通常在胚胎发育中活跃的转录因子，这些通路的重启可能导致组织形成异常的“隧道”。

提出统一理论：瘘管是一种“失调的伤口愈合”过程

研究最大的突破在于提出，尽管瘘管位置各异，但其背后存在共同的分子通路和细胞生态位（Niche）。

FAS细胞本质上是一个异常的伤口愈合群体，它们的程序在糖尿病溃疡等其他伤口愈合场景中也保守存在。但在克罗恩病中，由于持续的炎症和基因失调，这一愈合过程失控，最终导致了瘘管这种病理性“隧道”的形成和持久不愈。

结果2、发育转录因子对FAS细胞的调控作用

探究了FAS细胞中表达的转录因子如何指导成纤维细胞的功能。通过慢病毒载体，在原代肠道成纤维细胞中过表达了TWIST1和OSR2。

RNA-seq分析显示，TWIST1 诱导了以下通路：

ECM组织通路

MMP活性

纤维状胶原蛋白 的产生

形态发生相关信号（包括WNT信号通路）

此外，TWIST1还诱导了其他多个FAS表达或与瘘管相关的转录因子基因（PRRX2、VDR、SNAI1、SNAI2和GLI1）。其中，GLI1和SNAI1提示音猬因子信号通路的激活，该通路与成纤维细胞活化、ECM产生及肾间质纤维化的发展相关。TWIST1过表达还强烈下调了整合素及其他粘附分子的表达。

相比之下，OSR2 则主要诱导了以下程序：

发育模式形成 和 器官发生 相关基因（SIX2、ALX4、HOXA3、HOXA5、DLX2、NKX3-2、GLI3和FOXH1）

平面细胞极性 相关基因（CELSR2、FZD3、DLL1、PRICKLE1和GRHL3）

WNT和TGFβ信号通路 相关基因（FZD3、FZD5、RARG、BMP4和TGFB3）

值得注意的是，OSR2也能上调TWIST1 的表达。相应地，在TWIST1上调的基因中，有41%同样被OSR2显著上调；在TWIST1下调的基因中，有42%同样被OSR2显著下调。此外，只有OSR2（而非TWIST1）的过表达能强烈下调细胞骨架和细胞极性调节因子，包括编码丝状伪足和板状伪足蛋白的基因（FMNL2、FMNL3和DIAPH1）以及Rho GTPase通路基因。

形态学分析表明，OSR2+成纤维细胞失去了其纺锤状形态，并且鬼笔环肽染色和α-SMA表达减少，这与scRNA-seq数据显示FAS细胞下调ACTA2的结果一致。尽管细胞形态发生改变，但OSR2细胞并未显示成纤维细胞标志物（COL1A1、COL3A1、THY1和VIM）表达的显著降低，表明这些细胞仍保留了其成纤维细胞的身份。

结果3、克罗恩病溃疡中与瘘管相关的成纤维细胞

在所有克罗恩病溃疡的基底均发现了FAS样成纤维细胞，表明这类细胞是溃疡的普遍特征，而不仅仅是那些会发展成瘘管的溃疡所特有。

恶性转变的关键差异：

基因程序不同：

• 溃疡中的FAS样细胞：保留部分粘膜特征，功能上与上皮增殖和干扰素免疫应答相关。
• 瘘管中的FAS细胞：开启了全新的基因程序，上调了与细胞外基质（ECM）重塑和组织形态发生相关的基因，包括关键转录因子（如SNAI1, PRRX1等）。

细胞微环境不同：

• 溃疡微环境：富含T细胞、浆细胞、树突状细胞等，以适应性免疫细胞为主。
• 瘘管微环境：富含SPP1+和LYVE1+ 巨噬细胞以及增殖的内皮细胞，偏向于先天免疫和血管生成。

最终结论：从“修复”到“侵袭”的转变

瘘管的形成，是溃疡基底的FAS样细胞发生恶性转化的结果。这种转化使得细胞获得了侵袭性：它们通过上调基质降解酶和发育相关转录因子，激活纤维化和形态发生通路，在TGFβ信号和促迁移的ECM微环境支持下，从原本试图“修复”组织的细胞，转变为进行“侵袭”和“隧道式”生长的罪魁祸首。

结果4、FAS细胞促进上皮化

FAS细胞通过构建特殊微环境，驱动瘘管上皮化

构建促上皮化的微环境：

在上皮化前沿（leading edge） 的下方，存在一个独特的FAS细胞富集微环境。

这些FAS细胞上调表达WNT5A、WNT5B、NRG1和F3等关键信号分子，其行为类似于在正常肠隐窝中支持上皮干细胞的端细胞（telocyte）。

NRG1的信号最强点精确位于病变中最后一个可检测到的隐窝处，并与上皮细胞上的ERBB受体发生信号通讯，直接支持局部上皮的再生。

上皮化过程的紊乱与失调：

尽管FAS细胞发出再生信号，但瘘管上皮的反应系统是失调的：

部分瘘管上皮缺乏FZD5等WNT受体，可能无法正确接收再生信号。

BMP信号梯度被破坏，干细胞分化标记物减少。

增殖区域扩大，但干细胞关键转录因子ASCL2表达下降。

这表明瘘管的隐窝微环境是功能紊乱的，表现为成熟受阻和增殖过度。

FAS细胞的作用是暂时性的：

关键发现：一旦瘘管管道完全上皮化，其下的FAS细胞变得非常稀疏。

这表明FAS细胞的作用是阶段性的，它们聚集在上皮化前沿“推动”进程，一旦上皮覆盖完成，这个特殊的激活微环境就会解散，转变为更稳定的基质结构。

结果5、ECM重塑

FAS细胞通过差异化调控细胞外基质（ECM），共同维持瘘管的顽固性

不同的FAS亚型通过塑造不同性质的ECM，在瘘管持久存在中扮演了互补而又不同的关键角色。

ECM结构在瘘管中呈现特征性分层：

内层（管腔边缘）：主要为低密度、稀疏、无序的胶原，结构不连续。

外层（深部）：形成高密度、厚实、平行排列的纤维化胶原束，构成坚硬的瘘管边界。

健康组织的ECM（如粘膜下层）是短而卷曲的胶原束，赋予组织弹性；而瘘管中的ECM则被这种僵硬的、高密度的胶原所取代。

不同FAS亚型负责不同的ECM重塑任务：

FAS-LAZ 和 FAS-ALC细胞：定位于低密度ECM区域。它们与ECM的活跃重塑相关，表达MMP3等因子，在高低纤维化区域的边界进行精准的“ECM编辑”，为细胞迁移和隧道扩张开路。

FAS-FOZ细胞：富集于致密纤维化区域。它们主要负责促进纤维化，沉积坚硬的胶原，从而加固瘘管壁，稳定其结构。

最终模型：分工协作导致瘘管持久不愈

这创造了一个恶性循环：内层的FAS细胞不断重塑和破坏ECM以维持隧道的开放性并可能促进其扩展；而外层的FAS细胞则通过纤维化来加固这个隧道，使其难以闭合。

这种 “内部破坏，外部加固” 的分工模式，共同导致了瘘管的顽固性和持续性。

看看分析方法

空间病理学家注释。

单细胞数据分析

Xenium数据分析

细胞niche分析

共定位分析

visium部分

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