转录因子的“密码本”——玉米全长转录因子文库

一、背景介绍

转录因子（transcription factor，TF）是一类蛋白质，它们能够结合到DNA上的特定区域（称为转录因子结合位点）并调节基因的转录。转录因子能够影响基因表达，从而影响细胞的生长、分化和功能等方面。

转录因子文库是一种包含多种转录因子的集合，是研究基因调控网络的重要工具。它有助于理解特定转录因子如何与其他蛋白相互作用，进而调控基因表达和响应不同的生物学过程。

二、原理介绍

转录因子文库可以用于Y1H筛选调控启动子的转录因子，也可应用普通的核蛋白Y2H筛选与之相互作用的转录因子。

二者原理类似，酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。

在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域与目的基因连接作为诱饵质粒，对转录因子文库进行筛选，可以有效筛选到与目的基因互作的转录因子。

三、应用案例

以往的拟南芥转录因子文库常用于研究与转录因子相互作用的转录因子，以及与顺式作用元件相互作用的转录因子。

不同物种的转录因子应用类似，下面我们来通过这样一篇文献学习转录因子文库的使用。

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1.研究背景

玉米的内质网应激反应（UPR），这是一种细胞应对内质网中未折叠或错误折叠蛋白质积累的应激反应。

在不利环境条件下，如极端天气和病原体攻击，作物产量会受到严重影响，因为这些条件会增加蛋白质折叠的需求，超出内质网的生物合成能力，导致潜在的致命状况称为内质网应激。

UPR是一系列高度保守的监视通路，旨在清除内质网中的错折叠蛋白。对UPR的深入理解对于维持和可能提高作物产量至关重要，尤其是在全球人口预计到2050年将达到90亿的背景下，作物产量需要翻倍以满足粮食需求。

然而，对于UPR目标基因在ER（内质网）应激期间是如何被转录调控的，尤其是在作物如玉米中，目前知之甚少。

2.研究内容

鉴定UPR基因表达动力学背后的PDI

在大量物种中已经确定了UPR的大量转录变化，但这些物种中ER应激响应背后的基因调控中心的身份和动态尚未被绘制。

为了识别这些调控中心，分析了在ER应激过程中获得的玉米根的RNA-seq数据集，并选择了六个UPR靶基因，这些基因在ER应激过程中显示出独特的表达特征，并与ER稳态所需的重要细胞代谢过程直接相关。

为建立UPR靶基因-转录因子基因调控网络，使用玉米转录因子文库通过增强型酵母单杂交（eY1H）筛选，成功获得了262个转录因子和831个蛋白质-DNA互作（PDIs），这些PDIs涉及的转录因子与UPR靶基因的启动子结合，揭示了多个转录因子的组合作用，引领UPR靶基因的表达动态。

研究还发现了新的潜在PDIs，并与ChIP-seq数据集进行了比较，以验证筛选方法的准确性。

四、下游验证案例

由于多种因素的影响，单一的酵母单杂实验结果可能并不能完全证明该转录因子的互作状况，从上篇文献中我们发现转录因子文库筛选的互作，通过ChIP-seq数据集来验证。

那么常用的验证实验还有什么呢？ 我们通过以下的文献来了解一下。

图1 OsPHR2 通过 P1BS 元件直接调控菌根相关基因的表达

作者通过EMSA 和荧光素酶报告实验证实，OsPHR12可以直接结合并激活 OsRAM1、OsWRI5A、OsPT11、OsAMT3 启动子序列，并且这种结合依赖于启动子中的 P1BS 元件。

图2 体外确认TFs与Med25和PDF1.2启动子的GCC-Box的相互作用。

Med25/PFT1 被认为是拟南芥中 JA 依赖性防御的关键调节因子，作者通过转录因子文库鉴定了与Med25和PDF1.2启动子相互作用的TFs，通过GST pull-down 、EMSA体外确认 TFs 与Med25 和PDF1.2 启动子的 GCC-Box 的相互作用。

图3 细胞分裂素反应因子与 PCRE 相互作用

作者采用免疫共沉淀、定量PCR检测细胞分裂素反应因子与PCRE相互作用。

从上述这些案例可以发现，文库筛选后常通过ChIP、EMSA以及双荧光素酶报告基因等实验来验证筛结果，并根据该筛选结果进行转录因子互作分析以及转录因子作用机制分析。