10月最新26+生信，多组学空间免疫谱分析确定了三级淋巴结构（TLS）的亚群并进行深入分析，建议收藏！

一、文章信息

发表杂志名称：Immunity

中文标题：空间免疫谱分析确定了具有功能性三级淋巴结构的人类胶质瘤亚群

英文标题：Spatial immune profiling defines a subset of human gliomas with functional tertiary lymphoid structures

影响因子：26.3

发表日期：2025.10.21

二、研究概述

成人型弥漫性胶质瘤作为常见原发性脑肿瘤，对免疫治疗响应差，被视为免疫 “冷” 肿瘤。本研究通过空间转录组和蛋白质组分析，对 642 例胶质瘤进行研究，发现 15% 的胶质瘤存在三级淋巴结构（TLSs）。这些 TLSs 与血管周围空间重塑及细胞外基质成分空间重分布相关，可根据细胞组成和免疫活性分为三种亚型，虽均缺乏典型生发中心结构，但部分 TLSs 展现出克隆性 T/B 细胞扩增、IgA⁺和 IgG⁺浆细胞生成、树突状细胞 - T 细胞相互作用等动态免疫功能特征。且具有活跃免疫应答特征的 TLSs 与患者总生存期改善相关，表明部分胶质瘤中存在功能性适应性免疫应答，对胶质瘤分层和治疗具有重要意义。

三、研究结果

（一）成人型弥漫性胶质瘤中 TLS 的存在与患者总生存期改善相关

作者首先设计了成人型弥漫性胶质瘤中 TLS 的筛选策略，对 642 例肿瘤标本（452 例 IDH 野生型、190 例 IDH 突变型）进行抗 CD20 免疫组化（IHC）和 6 重多重免疫荧光（mIF）筛选，将包含≥50 个 CD20⁺B 细胞、且邻近有 CD3⁺T 细胞和 LAMP3⁺成熟树突状细胞的淋巴聚集物定义为 TLS，并对连续组织切片进行空间转录组分析（GeoMx DSP）、空间蛋白质组成像（31 重 mIF）和空间单细胞分析（Xenium）（图 1A）。随后统计原发性（434 例）和复发性（208 例）胶质瘤中 TLS⁺肿瘤的相对频率，发现原发性肿瘤中 TLS 的患病率略高于复发性肿瘤（图 1B）。通过多变量逻辑回归分析，作者确定 TLS 的存在与 IDH 突变状态无关（p=0.57），与肿瘤复发呈负相关（p=0.03），与男性性别（p=0.02）和颞顶叶肿瘤位置（p=0.01）呈正相关（图 1C）。在 382 例有生存和随访数据的患者中，采用多变量 Cox 比例风险回归分析，作者发现无论 IDH 突变状态、性别和诊断年龄如何，TLS 状态都是总生存期和无进展生存期的阳性预测因子（图 1D）。此外，作者对比 TLS⁺和 TLS⁻胶质瘤的肿瘤突变负荷（TMB），未发现显著差异，仅 3 例肿瘤（2 例 TLS⁺、1 例 TLS⁻）表现出高突变（TMB≥17 个突变 / Mb）。本部分明确了胶质瘤中 TLS 的筛选方法、分布特征及与临床预后的关联，为后续研究奠定基础。

（二）TLS⁺胶质瘤富含血管重塑相关转录本，且神经元特征转录本减少

作者对 44 例 TLS⁺和 20 例 TLS⁻成人型弥漫性胶质瘤进行转录组对比及差异基因表达分析和基因集富集分析（GSEA），制作热图展示两组间部分差异表达基因，发现 TLS⁻肿瘤无论 IDH 突变状态和患者性别如何，均表现出更高的神经元特性和突触功能相关转录本表达，如 SYT4、TNR、RAPGEF 等（图 2A）。相反，TLS⁺肿瘤中 B 细胞和浆细胞典型表达的转录本（如 IGHG1、IGHA1、IGKC）以及干扰素和白细胞介素信号相关转录本（如 IL2RB、IL1R1）水平更高（图 2A）。通过转录细胞类型解卷积，作者发现 TLS⁺肿瘤中免疫细胞（树突状细胞、浆细胞、髓系细胞）总体富集（图 2B）。同时，TLS⁺肿瘤中胶原基质相关转录本（如 COL6A1、COL1A1、COL3A1）和细胞外基质重塑相关转录本（如 MMP7）表达更高，且 COL6A1 在正常脑内不表达，在胶质瘤血管周围沉积增加，大型 TLS 中 COL6A1 网络扩展，这一结果通过空间蛋白质组分析得到验证（图 2C、2D）。利用 Xenium 空间单细胞转录组分析，作者确定壁细胞和成纤维细胞是 COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL6A1 表达的主要来源（图 2E），且转录细胞类型解卷积显示 TLS⁺肿瘤中壁细胞富集（图 2B）。此外，作者观察到血管周围 Col4 的重组（Col4 是血脑屏障的组成部分），并在 CD163⁺巨噬细胞内发现 Col4 片段，提示肿瘤相关巨噬细胞对细胞外基质成分的摄取（图 2D）。值得注意的是，在 TLS⁺胶质瘤样本中未检测到高内皮微静脉（HEV）标志物 MAdCAM-1 和 PNAd，表明淋巴细胞迁移相关的内皮特化有限。本部分从转录组和蛋白质组水平揭示了 TLS⁺与 TLS⁻胶质瘤的分子差异，尤其突出了 TLS⁺胶质瘤的血管和细胞外基质特征。

（三）TLS 亚型的转录特征反映其不同的细胞组成

作者分析 20 个肿瘤样本中 61 个 TLS 的转录谱，基于 CD20⁺免疫荧光染色选择每个样本 1-6 个 TLS 感兴趣区域（ROI），并以邻近的 CD20⁻肿瘤富集区域作为对照 ROI，发现 TLS ROI 中 MS4A1、CD19、CD3D、PTPRC 等免疫细胞转录本的表达比肿瘤对照 ROI 高 2-3 倍。通过对 TLS ROI 转录谱进行降维聚类，作者识别出三种具有不同转录谱的 TLS 亚型（图 3A）。第一种为 “T-low-TLS”（T 细胞丰度低），特征性表达 ACOT2、GRIN2C、ABCB9 等转录本，根据 GBM 单细胞参考图谱，这些转录本优先由神经元或星形胶质细胞表达（图 3A、3B），且转录细胞类型解卷积显示神经元样和干细胞样谱系的肿瘤细胞在 T-low-TLS 中富集（图 3C）。第二种为 “B:T-TLS”（B 细胞与 T 细胞相互作用），特征性表达抗原呈递相关基因（如 CD74、HLA-B、HLA-DRA），这些基因主要由巨噬细胞、B 细胞和树突状细胞表达（图 3A、3B）。第三种为 “PC-TLS”（浆细胞丰富），浆细胞表达基因（如免疫球蛋白基因片段、DERL3、TENT5C）水平更高（图 3A、3B）。转录细胞类型解卷积显示，与 T-low-TLS 相比，B:T-TLS 和 PC-TLS 中 B 细胞、T 细胞和壁细胞更丰富（图 3D）。将空间转录组的 TLS 亚型注释与高重免疫荧光和空间单细胞分析数据匹配，作者进一步证实了细胞组成的差异：B:T-TLS 和 PC-TLS 中 CD4⁺和 CD8⁺T 细胞比例高于 T-low-TLS，而 CD163⁺巨噬细胞在 T-low-TLS 中富集（图 3E）；且 PC-TLS 的细胞核计数更多，占据面积大于 T-low-TLS 和 B:T-TLS（图 3F、3G）。此外，作者未发现 IDH 突变状态与 TLS 亚型之间存在显著关联（图 3A）。本部分明确了三种 TLS 亚型的分子特征和细胞组成差异，为后续功能分析提供了亚型基础。

（四）B:T-TLS 和 PC-TLS 表现出动态适应性免疫激活特征

作者首先对比扁桃体生发中心（GC）与胶质瘤 TLS 的结构，发现胶质瘤相关 TLS 中未识别出具有大量淋巴细胞增殖的典型生发中心（图 4A）。但通过 mIF 图像分析，作者观察到 B/T 细胞分区的迹象：B:T-TLS 和 PC-TLS 中 T 细胞与其最近 B 细胞的平均距离略大于 T-low-TLS（图 4B），且在 15μm 距离内 T 细胞的百分比低于 T-low-TLS（图 4C），密度热图也显示 T-low-TLS 中 T 细胞和 B 细胞更混合，而 B:T-TLS 和 PC-TLS 中它们倾向于聚集在不同区域（图 4D）。高重免疫荧光染色显示，增殖性 CD20⁺Ki67⁺B 细胞和 CD4⁺Ki67⁺T 细胞分别聚集在 TLS 的 B 细胞富集区和 T 细胞富集区，表明 TLS 内适应性免疫细胞的增殖和克隆扩增（图 4E），且这些增殖细胞在 B:T-TLS 中百分比最高，约占所有 B 细胞的 3% 和所有 CD4⁺T 细胞的 4%（图 4F、4G）。同时，B:T-TLS 簇中 B 细胞最大密度最高，提示 B 细胞通过克隆扩增聚集（图 S5A），而不同 TLS 类型中 B 细胞的平均密度相当（图 S5B）。作者还发现 CD4⁺PD1⁺ICOS⁺滤泡辅助性 T 细胞（Tfh）表型，但各 TLS 亚型间无显著差异（图 S5F、S5G）。此外，TLS 内 60%-90% 的 B 细胞和 30%-80% 的巨噬细胞表现出 CD74⁺表型，提示其具有抗原呈递功能（图 4H-4J）；LAMP3⁺树突状细胞定位在 T 细胞附近（图 4E），在 B:T-TLS 中约占所有免疫细胞的 2%，而在其他亚型中占比不足 0.5%（图 4K）。值得注意的是，在所有分析的 TLS 中均未检测到 CD23（提示无滤泡树突状细胞）（图 4A），且仅部分 TLS⁺肿瘤中检测到低水平的 AICDA、CR2、CXCL12、CXCL13 转录本（图 S5C）。本部分揭示了 B:T-TLS 和 PC-TLS 具有活跃的免疫细胞增殖、抗原呈递等动态适应性免疫特征，而 T-low-TLS 在免疫功能上相对不活跃。

（五）胶质瘤相关 TLS 中存在 B 细胞向浆细胞的分化

作者通过高重免疫荧光染色，在 TLS 区域内外均发现了 IgG⁺CD38⁺MZB1⁺和 IgA⁺CD38⁺MZB1⁺表型的类别转换浆细胞，且 PC-TLS 和部分 B:T-TLS 中 TLS 内外浆细胞比例最高（图 5A、5B）。利用 Xenium 空间单细胞转录组数据计算单个 TLS 内所有 B 细胞和浆细胞的 B 细胞分化评分，作者发现三种 TLS 类型中均存在从成熟初始 B 细胞（TCL1A、IGHD）到记忆样 B 细胞（IGHG1、CD27、CD19）再到浆母细胞样 B 细胞（CD19、CD20、CD27、CD38）的连续分化阶段，而分化程度更高的浆细胞（高表达 IGHG 或 IGHA，同时高表达 MZB1，低表达 CD19 和 MS4A1）主要存在于 PC-TLS 中（图 5C）。为探究肿瘤组织内 B 细胞和浆细胞的克隆动态，作者对 TLS⁺和 TLS⁻胶质瘤的新鲜冷冻组织标本进行免疫球蛋白重链转录本的 bulk 测序，未从 TLS⁻肿瘤中扩增出免疫球蛋白 cDNA（作为阴性对照）。对 3 例 TLS⁺胶质瘤的免疫球蛋白库分析显示，免疫球蛋白 G（IgG）转录本占主导，免疫球蛋白 A（IgA）亚型次之（图 5D），与免疫荧光和空间转录组数据中观察到的浆细胞表型一致。此外，作者观察到源自同一原始 VDJ 重组事件的免疫球蛋白重链克隆家族扩增，这些克隆家族表现出多种免疫球蛋白亚型（IGHG、IGHA）和广泛的体细胞超突变（图 5E、5F）。本部分证实了胶质瘤相关 TLS 中存在 B 细胞向浆细胞的分化过程，且伴随克隆扩增和体细胞超突变，提示 TLS 具有产生肿瘤特异性抗体的潜力。

（六）B:T-TLS 内细胞毒性 T 细胞与树突状细胞存在相互作用

作者对 Xenium 空间单细胞转录组数据中的 T 细胞群体进行亚聚类，基于标志基因表达谱识别出不同的 T 细胞亚群（Th17 淋巴组织诱导细胞 [LTi]、Tfh、CD8⁺细胞毒性 I 型、CD8⁺细胞毒性 II 型）（图 6A）。其中，CD8⁺细胞毒性 I 型表达 GZMK、GZMA、EOMES 等标志物，CD8⁺细胞毒性 II 型则独特地高表达 GZMB、GNLY、KLRD1（图 6A、S6A）。通过受体 - 配体相互作用建模，作者发现树突状细胞与 T 细胞亚型之间通过整合素、CTLA4 和 CD28 存在显著相互作用（图 6B），且 CD8⁺细胞毒性 II 型最高表达 ITGAX 和 ITGAM（这些整合素可促进与树突状细胞表达的 ICAM1 的相互作用）（图 6A、6B）。量化 T 细胞亚群与树突状细胞的距离，作者发现 CD8⁺细胞毒性 II 型与树突状细胞的距离显著近于包括 CD8⁺细胞毒性 I 型在内的其他任何 T 细胞亚群（图 6C-6E）。这种空间邻近性结合受体 - 配体相互作用建模结果，表明 B:T-TLS 内 CD8⁺细胞毒性 II 型 T 细胞与树突状细胞存在优先相互作用。本部分揭示了 B:T-TLS 中树突状细胞与特定细胞毒性 T 细胞亚群的相互作用，为理解 TLS 的抗肿瘤免疫机制提供了关键线索。

（七）功能性 TLS 可作为胶质瘤免疫许可微环境的生物标志物

作者首先统计每个肿瘤中不同 TLS 亚型的数量，发现同一肿瘤中可能存在多种 TLS 亚型，但通常有一种亚型占主导（图 7A、7B），据此将 TLS⁺肿瘤分为两类：“TLS type 1 胶质瘤”（主要含 B:T-TLS 和 PC-TLS，即胶质瘤中观察到的最成熟、功能最强的 TLS 亚型）和 “TLS type 2 胶质瘤”（主要含功能较弱的 T-low-TLS）（图 7A、7B）。分析肿瘤内在因素对 TLS 亚型分布的影响，作者发现与 TLS type 1 胶质瘤和无 TLS 肿瘤相比，TLS type 2 肿瘤中细胞周期、糖酵解、缺氧和 VEGF 信号相关通路的表达更低（图 7C），且免疫组化 Ki67⁺评分也证实 TLS type 2 肿瘤的增殖率更低（图 7D）。此外，TLS type 2 胶质瘤的坏死区域比 TLS type 1 胶质瘤更广泛（图 7E、S7A），且 B:T-TLS 和 PC-TLS 常靠近软脑膜或与软脑膜直接相关，提示软脑膜参与功能性适应性免疫应答（图 S4E、S7B）。这些结果表明，肿瘤微环境（TME）是胶质瘤中 TLS 成熟的关键决定因素，TLS type 1 胶质瘤中的免疫许可微环境促进 TLS 成熟，而功能性 TLS 可用于识别具有免疫许可微环境的胶质瘤，这类胶质瘤可能比典型的免疫抑制性胶质瘤微环境更易接受免疫治疗。为评估 TLS 成熟度作为预测性生物标志物的潜力，作者分析了一个将转录组谱与免疫治疗响应相关联的分子数据集，构建基于浆细胞和树突状细胞相关基因表达水平的 “功能性 TLS 评分”（图 7F），发现对免疫治疗有响应的患者肿瘤具有更高的功能性 TLS 评分，提示 TLS 成熟度与治疗效果相关，但由于患者队列较小，需在更大数据集中进一步验证。最后，作者设计了一种简单的染色方案用于区分三种胶质瘤亚群：通过 CD20 IHC 检测 TLS⁺肿瘤，随后对 TLS⁺肿瘤进行 CD20（B 细胞）、CD3（T 细胞）、MZB1（浆细胞）、LAMP3（树突状细胞）的多重染色，并根据阈值（MZB1⁺细胞 < 3%、LAMP3⁺细胞 < 0.25%、CD20⁺/CD3⁺细胞比值 > 1.5）将 TLS 分类为 T-low-TLS，TLS⁺肿瘤中超过 50% 的 TLS 被归类为 T-low-TLS 则标记为 TLS type 2 胶质瘤，其余 TLS⁺肿瘤标记为 TLS type 1 胶质瘤（图 7G）。对 IDH 野生型胶质瘤亚群的生存分析显示，TLS type 1 胶质瘤患者比 TLS type 2 胶质瘤患者具有显著的生存优势，而 TLS type 2 胶质瘤患者的生存结局与 TLS⁻胶质瘤患者相当（图 7H）。本部分明确了 TLS 成熟的影响因素，证实了功能性 TLS 作为免疫治疗潜在预测标志物的价值，并提供了简便的临床分类方案。

四、研究总结

本研究对 642 例成人型弥漫性胶质瘤进行系统分析，发现 15% 的胶质瘤存在三级淋巴结构（TLSs），且这些 TLSs 与患者总生存期改善相关。通过多模态空间分析（空间转录组、蛋白质组、单细胞分析），研究将 TLSs 分为 T-low-TLS、B:T-TLS 和 PC-TLS 三种亚型，其中 B:T-TLS 和 PC-TLS 展现出克隆性淋巴细胞扩增、浆细胞生成、树突状细胞 - 细胞毒性 T 细胞相互作用等功能性适应性免疫特征，而 T-low-TLS 功能较弱。进一步研究表明，肿瘤微环境（TME）是 TLS 成熟的关键因素，TLS type 1 胶质瘤（富含 B:T-TLS 和 PC-TLS）具有免疫许可微环境，而 TLS type 2 胶质瘤（富含 T-low-TLS）存在缺氧、坏死等抑制性微环境。此外，研究构建的 “功能性 TLS 评分” 与抗 PD1 免疫治疗响应相关，且设计了基于免疫染色的简便分类方案用于胶质瘤亚群区分。该研究挑战了胶质瘤为 “免疫冷” 肿瘤的传统认知，揭示了部分胶质瘤中存在活跃免疫应答，为胶质瘤的免疫分层和免疫治疗策略优化提供了重要依据。