海星生物提供CRISPR文库体内筛选解析MS巨噬细胞极化网络

在神经炎症如多发性硬化症（MS）中，巨噬细胞具有损伤与修复的双重功能，但体内调控其状态转换的关键信号不明。传统方法难以模拟真实微环境或进行高通量筛选。2025年12月，慕尼黑大学医院临床神经免疫学研究所和慕尼黑工业大学医学与健康学院团队首次建立了可规模化的CRISPR文库体内筛选平台，直接在小鼠神经炎症模型中，对超过100个细胞因子相关基因进行了高通量功能筛选，精准鉴定出IFN-γ、TNF、TGF-β和GM-CSF 四大核心信号，并在单细胞与活体层面阐明其分工机制。该研究为神经免疫调控提供了新范式，也为先天免疫药物研发开辟了新道路。

本文中核心的CRISPR文库体内筛选实验，正是得益于先进的CRISPR慢病毒文库构建与体内验证技术。海星生物（HySigen）作为国内领先的CRISPR筛选服务商，提供的正是此类全流程、高覆盖率的体内外CRISPR筛选一站式解决方案，帮助研究者将体外文库高效移植到复杂体内环境中，实现真正“生理状态”下的基因功能解析。

核心方法创新

本研究最大的亮点在于方法学上的突破，建立了一套完整的“体内Perturb-seq”流程。

1.可编辑的细胞：研究人员使用Hoxb8FL细胞（一种永生化造血前体细胞系）作为载体。这些细胞易于在体外扩增和进行CRISPR-Cas9基因编辑。

2.构建KO文库：针对64个细胞因子受体和45个下游信号分子，构建了一个包含343个sgRNA的CRISPR敲除文库，确保每个基因被多向导RNA靶向。

3.体内筛选与读取：

(a) 将编辑后的Hoxb8FL细胞在体外向髓系分化后，静脉注射到患实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE，MS小鼠模型）的小鼠体内。

(b) 这些细胞能成功归巢到炎症中枢神经系统（CNS），并分化成与内源性巨噬细胞性状相似的细胞。

(c) 在疾病高峰期，从脊髓等部位分选出不同极化状态（如促炎的iNOS⁺和抗炎的Arg1⁺）的移植来源巨噬细胞。

(d) NGS测序比较不同细胞群体中sgRNA的丰度变化。

(e) 结合单基因验证、Perturb-seq（CRISPR+scRNA-seq）、骨髓嵌合体、氧化还原活体成像等多种技术进行多维度验证。

这种方法克服了传统体内基因功能研究的局限性，实现了在真实病理环境中、对大量基因进行并行、细胞特异性的功能丧失性筛选。

重点研究发现与解读

1. CRISPR文库体内筛选鉴定4大核心细胞因子受体

根据CRISPR文库体内筛选发现了四条不可或缺的信号通路：

• IFN-γR1和TNFR1强烈促进iNOS⁺极化 

• TGF-βR1抑制iNOS⁺、促进Arg1⁺极化 

• GM-CSFR（CSF2RA）促进Arg1⁺极化 

• CCR2是唯一控制CNS入脑的关键受体（图1f–h）

图1.CRISPR文库体内筛选实验发现了调控神经炎症损伤中巨噬细胞极化的细胞因子受体

2. 单基因验证及下游信号通路解析

进一步的单基因敲除验证了这些结果，并明确了其下游关键转导分子：

• IFN-γ→JAK1/2-STAT1驱动iNOS

• TNF→IKK2（经典NF-κB）驱动iNOS

• TGF-β→SMAD4双向调控（抑制iNOS、促进Arg1）

• GM-CSF→未知下游（非STAT5）促进Arg1（图2）

图2.细胞因子受体对巨噬细胞极化作用的验证以及其关键下游介质的鉴定

3. Perturb-seq揭示单细胞水平的分化轨迹变化

为解析上述细胞因子如何具体影响巨噬细胞的转录组和群体异质性，研究者对野生型、Hoxb8FL移植和骨髓嵌合体来源的病灶巨噬细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），结合CRISPR敲除（Perturb-seq），分析敲除特定受体后巨噬细胞亚群组成和基因表达的变化。

结论

IFN-γ和TNF作用相反：IFN-γ信号维持早期/促炎性巨噬细胞亚群，而TNF信号反而促进巨噬细胞向更晚期的表型进展。

TGF-β和GM-CSF功能重叠：两者均抑制早期CXCL10⁺炎症巨噬细胞，并促进巨噬细胞向晚期亚群分化，尤其在“组织重塑”功能上协同作用（图3）。

图3. Pertub-seq在单细胞水平上揭示了巨噬细胞的细胞因子调控

4. 从基因表型到具体功能：调控损伤与修复

为了探究关键细胞因子如何直接调控巨噬细胞的具体致病或修复功能，研究者分析敲除细胞中与“损伤促进”（如趋化因子、活性氧产生）和“损伤缓解”（如组织重塑、脂质代谢）相关基因特征集的变化；将表达Grx1-roGFP2氧化还原传感器的工程化细胞移植入小鼠，活体成像直接观测体内巨噬细胞的氧化爆发状态。

结论：

功能调控：促炎功能主要由IFNGR1、TNFR1和CSF2RA信号支撑，而被TGFBR1信号抑制；修复功能则主要由TGFBR1信号驱动（图4a，图5a）。

氧化爆发：IFN-γ信号是体内巨噬细胞氧化爆发的主要驱动者（图4b-f），直接关联于组织损伤。

脂质清除：TGF-β信号对于巨噬细胞有效清除脂质至关重要。缺乏TGFBR1的巨噬细胞虽然吞噬功能正常，但脂质外排能力受损，导致细胞内脂滴和胆固醇晶体堆积，转变为促炎的“泡沫细胞”表型（图5b-p）。

图4.细胞因子受体的缺失会以不同方式调节神经炎症中巨噬细胞的损伤促进特性

图5.细胞因子受体的缺失对神经炎症中巨噬细胞的病变溶解特性有差异调节

5. 基因集富集分析显示TGFβ是中枢神经系统组织侵入的调控因子

无偏倚基因集富集分析发现，TGFBR1缺失显著影响与细胞粘附和迁移相关的基因（图6a）。研究者还定量分析TGFBR1敲除与对照细胞在软脑膜和脑实质病变中的分布比例；应用活体双光子显微成像，直接追踪病灶内巨噬细胞的运动轨迹和速度。

结论：

特异性分布缺陷：TGFBR1缺失的巨噬细胞几乎无法进入软脑膜，但在脑实质病灶中数量增多。这种分布异常是TGF-β信号特有的，在其他细胞因子受体敲除细胞中未见。

运动能力正常：活体成像显示，缺失TGFBR1的巨噬细胞在实质内的运动速度和移动细胞比例均未改变。

机制阐释：这表明TGF-β信号并不影响巨噬细胞的运动能力，而是特异性地调控它们从脑膜向脑实质病灶的浸润过程，如同指挥免疫细胞穿越一道“特许门槛”。这为理解TGF-β在神经炎症中的复杂作用（如在某些情况下反而加重炎症）提供了新的空间生物学视角（图6e, f）。

图6. TGFβ信号通路决定了巨噬细胞在脊髓自身免疫性炎症病变区域的定位，但并不影响其在该区域内的移动性

6.从模型到患者：构建跨物种、跨脑区的细胞因子活动图谱

为了将小鼠模型中发现的关键细胞因子调控网络，转化为可应用于人类疾病分析的生物标志物，并验证其保守性与特异性。研究者基于小鼠Perturb-seq数据，提取由IFN-γ、TNF、GM-CSF、TGF-β特异性诱导的基因集（图7a）；在小鼠的脑脊液（CSF）、皮质灰质病灶等不同中枢神经系统各区域的免疫细胞单细胞数据中，分析这些特征的表达（图7c-h）；还结合MS患者和对照者的CSF单核细胞（图8a, b）以及脑组织小胶质细胞（图8c-f）的单细胞数据，计算并比较这些特征的活性。

结论：

特征保守：这些特征在髓系细胞（包括小胶质细胞）中高度富集，且在不同CNS区域（白质、灰质、CSF）保守，证明了调控逻辑的普适性。

疾病特异性激活：在人类MS中，IFN-γ特征在CSF单核细胞中被特异性激活，这与MS患者CSF中IFN-γ水平升高的报道一致（图8b）。

病灶内细胞状态解码：在MS脑白质病灶中，不同的小胶质细胞亚群呈现独特的细胞因子特征谱：促炎/干扰素应答小胶质细胞高表达IFN-γ特征；疾病相关和脂质处理小胶质细胞广泛激活GM-CSF特征；而与修复/缓解期相关的MHCII高表达小胶质细胞则富含TGF-β特征（图8f）。有趣的是，TNF特征在人类病灶小胶质细胞中未显着富集，暗示其作用可能更多通过其他细胞类型介导。

区别于神经退行性疾病：这些特征的激活在阿尔茨海默病等神经退行性疾病的类似细胞中未观察到，突出了其在神经炎症中的特异性。

图7.神经炎症细胞因子信号连接骨髓细胞调节跨MS模型

图8.神经炎症性细胞因子特征揭示了多发性硬化症中髓系细胞在中枢神经系统各部位的调控作用

总结与启示

这项研究通过创新的体内CRISPR筛选结合单细胞测序与活体成像，系统揭示了神经炎症中巨噬细胞命运的精确调控网络：

定性：鉴定出IFN-γ/TNF 驱动促炎状态，TGF-β/GM-CSF 主导修复程序。

定量与功能：在单细胞水平解析了各信号对细胞亚群动态及具体功能（如氧化爆发、脂质清除）的调控。

空间与临床：首次发现TGF-β 特异调控巨噬细胞从脑膜向实质病灶的“空间导航”；并构建出可在人类MS患者脑脊液和脑组织中验证的保守细胞因子活性特征。

该研究建立的“体内Perturb-seq”范式——利用工程化前体细胞进行高效体内基因功能筛选——具有里程碑意义，可广泛适用于肿瘤、免疫、代谢等领域的靶点发现。

技术服务：CRISPR/Cas9细胞基因编辑、CRISPR文库筛选/文库病毒/载体构建、分子诊断参考品/突变基因参考品/融合基因参考品、细胞稳转 / 细胞干扰

细胞试剂：HyCyte®干细胞/原代细胞/细胞株、三系诱导培养试剂、细胞专用培养基、基因编辑试剂盒、病毒现货、预筛选胎牛血清