2024年，中国农业大学动物科学技术学院杨宁教授/孙从佼副教授团队与中国农业科学院深圳农业基因组研究所易国强研究员课题组在《Journal of Advanced Research 》期刊在线发表了题为《Single-nucleus transcriptional and chromatin accessible profiles reveal critical cell types and molecular architecture underlying chicken sex determination》的论文。该研究在单细胞水平系统揭示了鸡性别决定的分子机制，为性别控制技术的开发奠定了理论基础。

PART.01｜样本与实验设计

样本来源：

纯系白来航鸡胚胎，分离 E3.5（生殖嵴 + 中肾）、E4.5（左侧性腺）、E5.5（左侧性腺）的雌雄样本；

技术平台：

10X Genomics 单细胞多组学测序（snRNA-seq + snATAC-seq），同时结合 RNAscope 原位杂交验证；

测序参数：

snRNA-seq 采用 PE150 策略，每个核≥50,000 reads；snATAC-seq 采用 PE50 策略，每个核≥25,000 reads；

跨物种验证：

整合人、猕猴、小鼠、猪、山羊的性腺单细胞数据，分析脊椎动物性别决定的保守性。

PART.02｜研究成果

单核多组学开启鸡性腺细胞图谱新纪元

作者首先通过单核RNA测序（snRNA-seq）和染色质可及性测序（snATAC-seq），对鸡胚胎性腺在E3.5、E4.5和E5.5阶段进行时间序列分析，以解析性别决定过程中的细胞异质性和分子特征。成功获取了61,503个转录组数据和25,587个可及性图谱数据。利用这些数据，分析识别出16种细胞类型，包括间质细胞、支持细胞和生殖细胞。细胞在性别间的整体分布相似，但支持细胞和上皮细胞在雄性中的比例更高，这暗示性别分化可能始于E5.5阶段。这一发现为后续的细胞特异性分析奠定了坚实基础。

染色质可及性揭秘细胞命运调控密码

作者深入分析了细胞类型特异性的染色质可及性。通过差异可及区域（DARs）分析和motif富集，评估了TFs结合位点。结果发现38,567个DARs（未去重）在13种细胞类型中差异显著，其中生殖细胞DARs占比最高（28.2%）；功能富集显示DARs相关基因参与上皮细胞迁移和类固醇代谢等过程。TF活性分析揭示HNF1B在肾小管细胞中高表达，EBF1在间质和内皮细胞中活跃，表明染色质可及性与基因表达高度相关。这些发现强调了表观遗传调控在性别决定中的核心作用，为后续支持细胞分析提供了分子基础。

支持细胞表观遗传驱动性别决定关键因子

为进一步剖析支持细胞在性别决定过程中的关键转录因子（TFs）及其调控网络，研究者借助基序（motif）富集分析与转录因子足迹分析方法，着重聚焦于NR5A2、NR5A1、ESRRG和DMRT1等因子。研究结果显示，ESRRG和DMRT1在支持细胞差异可及区域（DARs）呈现显著富集态势，且足迹分析亦证实这些基序周围区域的DNA可及性有所增加。DMRT1在雄性个体中的表达水平与活性均相对较高，这表明其可能作为先锋转录因子驱动睾丸发育进程。值得关注的是，ESRRG在雌性个体中表达较强，而在雄性个体中基序活性较高，这暗示其存在复杂的调控机制。上述研究结果共同揭示了支持细胞分化的表观遗传驱动因素，为深入理解鸡的性别决定机制提供了全新视角。

细胞异质性勾勒鸡性别分化早期路径

通过对6412个支持细胞开展再聚类分析，成功识别出8个亚群（例如未分化支持细胞、前Sertoli细胞以及前颗粒细胞）。PAX2于未分化细胞中呈现高表达状态，然而在细胞分化后表达水平下降；DMRT1在雄性细胞中显著上调表达，而CYP17A1在特定亚群中表现出活跃的表达态势。这一结果证实了支持细胞的分化轨迹：雌性分化路径保留PAX2等标记物，而雄性分化路径则转向以DMRT1为主导。借助SCENIC和染色质可及性分析方法，研究发现转录因子DMRT1在雄性支持细胞中展现出高活性，其motif周边染色质的开放性显著增强，并且通过顺式共可及性网络（CCAN）对基因表达进行调控。与此同时，JUN和FAM172A等基因呈现出性别二态性表达特征，此现象已通过RNAscope实验得以验证。这些研究结果不仅精准刻画了支持细胞分化的动态轨迹，还明确揭示了DMRT1作为先锋因子，通过表观遗传重编程主导睾丸发育的内在机制。

雄性支持细胞轨迹揭示睾丸发育动态

为了继续聚焦于雄性支持细胞的发育轨迹和调控网络研究，作者首先对雄性支持细胞进行细分，识别出五个关键亚群，包括未分化支持细胞、前Sertoli细胞及其过渡态细胞。并且发现雄性支持细胞沿明确的分化路径从未分化状态向终末分化的前Sertoli细胞转变。这一轨迹在snRNA-seq和snATAC-seq数据中高度一致，证实了对分化过程分析的可靠性。

雌性支持细胞特征凸显卵巢形成机制

继续聚焦2,923个雌性细胞的生信分析，结果显示雌性轨迹更复杂，前颗粒细胞保留PAX2和POSTN标记，但CYP17A1表达升高；伪时间分析显示PAX2和MEIS2可及性下降，而TEAD家族TF富集，在卵巢发育中，适当地抑制细胞增殖是至关重要的。与睾丸需要大量增殖以形成精细的曲细精管结构不同，卵巢的发育更侧重于细胞的特化和结构的稳定形成。因此，TEAD家族的富集和激活，恰好提供了这种“刹车”信号，抑制支持细胞/前颗粒细胞的过度增殖，从而促进卵巢的正常发育和分化。这些结果完善了性别决定模型，显示雌性路径更依赖维持未分化状态。

跨物种比较证实性别决定进化守恒

为了进一步评估支持细胞在脊椎动物中的共同特征，作者设计了跨物种比较，以探讨细胞进化保守性，通过整合人类、猕猴、小鼠、猪、山羊和鸡的单细胞数据，使用SAMap进行同源分析。主要结果显示，细胞类型（如支持细胞和内皮细胞）高度保守，支持细胞转录模式相似；DMRT1在多种物种中表达，但SOX9在鸡中限于肾源细胞，显示其物种的特异性。这些发现强调了性别决定机制的进化延续性，支持鸡作为生物医学模型的价值。整体上，本研究通过多组学整合，系统揭示了鸡性别决定的细胞和分子架构，为禽类性别决定调控和进化生物学提供了重要资源。

PART.04｜总结

本项具有突破性的研究借助单核多组学技术，首次绘制出鸡胚胎性腺性别决定的高分辨率图谱。研究团队对单细胞RNA测序（snRNA - seq）与单细胞染色质可及性测序（snATAC - seq）数据进行整合，成功解析了胚胎发育第3.5天至第5.5天关键发育期细胞命运抉择的分子机制。

本研究意义重大：既为禽类性别控制育种提供了全新靶点，有助于解决蛋鸡产业中雄性雏鸡处理所涉及的伦理问题，又揭示了脊椎动物性别决定的进化保守性，为人类性发育疾病的研究提供了重要参考依据。