一代、二代、三代DNA测序史

        DNA测序技术是现代生命科学的基石，它的发展历程可以清晰地划分为三个主要阶段，每一代技术都在通量、速度、成本和读长上实现了巨大飞跃。

1.    第一代测序：奠基时代

核心代表：桑格测序法 (Sanger Sequencing)

时间：1977年由弗雷德里克·桑格发明，直至2000年代中期为主流技术。

原理：也称为“链终止法”。使用一种特殊的dNTP（双脱氧核苷酸，ddNTP）作为链终止子。通过进行四个独立的反应，每个反应含有不同的ddNTP（如ddATP），来生成一系列长度不同但末端已知的DNA片段。这些片段通过高分辨率的凝胶电泳或毛细管电泳分离，并根据其末端的ddNTP读出序列。

特点：

优点：读长长（可达1000 bp），准确率极高（>99.999%），被视为“黄金标准”。

缺点：通量低、速度慢、成本极其昂贵。

里程碑：完成了人类基因组计划的绝大部分工作，耗时13年，耗资约30亿美元。

2.    第二代测序：高通量时代 (NGS)

核心思想： 从“一个反应管一条序列”变为大规模并行测序，一次运行可产生数十亿条短读长序列。

时间：2005年左右开始商业化并迅速成为主流。

代表技术：Illumina (Solexa) 的边合成边测序技术是目前绝对的主流。其他还包括Ion Torrent（半导体测序）和454焦磷酸测序等。

原理（以Illumina为例）：

        ● 文库制备：将DNA随机打断成小片段，并在两端连上接头。

        ● 桥式PCR：将DNA片段固定在芯片上，进行克隆扩增，形成一个个簇。

        ● 边合成边测序：逐个循环添加带荧光标记的dNTP。每加入一个互补的碱基，就会释放出荧光信号，被相机捕获，从而确定碱基序列。

特点：

优点：通量巨大、速度极快、成本呈指数级下降（人类基因组测序成本降至1000美元以下）。这使得大规模基因组、转录组、表观基因组等研究成为可能。

缺点：读长短（通常为50-300 bp），需要PCR扩增（可能引入偏差），后续数据处理复杂。

3.    第三代测序：长读长与实时测序时代

核心思想： 单分子实时测序，无需PCR扩增，直接对单个DNA分子进行测序。

时间：2011年左右开始出现，目前仍在快速发展和完善中。

代表技术：

Pacific Biosciences (PacBio) 的SMRT技术：基于零模波导孔，实时监测DNA聚合酶合成DNA时掺入的带荧光标记的核苷酸。

Oxford Nanopore Technologies (ONT) 的纳米孔技术：让DNA分子穿过一个纳米级别的蛋白孔，通过测量电流变化来识别不同的碱基。

特点：

优点：

超长读长（PacBio平均读长可达数万至数十万碱基，Nanopore读长理论无上限）：能够跨越复杂的重复序列区域，完美解决基因组组装难题。

无需PCR：避免了扩增引入的错误和偏差，能直接检测表观遗传修饰（如碱基甲基化）。

实时：数据可实时读取，在病原体快速检测、野外环境监测等领域有巨大优势。

仪器便携（特别是Nanopore的MinION设备仅有U盘大小）。

缺点：原始读长错误率较高（但通过循环共识测序或多次测序可大幅纠正），成本仍高于NGS（但下降迅速）。

4.    总结对比

5.    发展趋势

        目前，科研界常采用 “混合策略”，即利用NGS的高准确度和低成本进行大面积测序，同时利用三代测序的长读长来解决基因组中的疑难区域，从而实现完美、完整的基因组组装。三代和未来可能出现的四代测序技术正朝着更长的读长、更高的准确度和更低的成本方向不断前进。