在初级运动皮层操控谷氨酸能神经元活动调节正常和心肌梗死小鼠的心脏功能

Figure 1 通过心脏衍生的伪狂犬病病毒追踪对全脑成像

1. PRV-EGFP和PRV-mRFP-通过心脏衍生的伪狂犬病病毒追踪对全脑成像

技术用途与注射策略解释：

将PRV-EGFP和PRV-mRFP分别注射到左心室壁和右心室壁，可以用于追踪心脏感知神经元或运动神经元的投射模式。因为PRV具有跨突触传播能力，病毒会从注射部位的组织进入神经末梢，并沿神经通路逆行传播，从而标记相关的上游神经元。

这种方法特别适用于：

探索心脏不同区域的神经支配；

比较左、右心室在神经支配网络上的差异；

构建“脑-心轴”解剖图谱等研究。

2. fMOST与组织透明化成像

fMOST（fluorescence micro-optical sectioning tomography）是由中国科学家发展的一种高分辨率全脑成像技术。它的流程包括：

将小鼠大脑用树脂包埋；

用极薄的厚度（一般为1 μm）进行连续物理切片；

每切一层，就用共聚焦显微镜拍照；

最终拼接还原为完整的单细胞分辨率的三维大脑图谱。

优点：

分辨率极高（可达亚细胞水平）；

成像深度不受限制；

特别适用于脑神经元追踪、脑图谱绘制。

缺点：

是破坏性的，成像后组织不可逆；

数据量极大，处理复杂。

💡 组织透明化简介：

如CLARITY、uDISCO、iDISCO+、SHIELD等技术，主要原理是将组织中的脂质等折射率不均匀部分清除，使组织变得透明，然后使用光片显微镜（LSFM）或共聚焦显微镜进行深层成像。

优点：

可保存完整组织（非破坏性）；

可多轮染色、成像；

适合多通道荧光标记。

缺点：

分辨率较fMOST低；

透明化过程复杂，对标本损伤风险较高；

大样本清晰度有限。

在注射后第3天，常规与自主神经调控心脏相关的区域（如M1、PVN等）尚未出现病毒标记神经元（见图S1），说明这些区域距离心脏较远，病毒还未扩散到达。

提示：PRV需要时间进行多突触跨越，从心脏传回大脑高阶区域，早期主要集中在脑干和下丘脑。

然而，5.5天时，出人意料地在大脑皮层的：

M1区（初级运动皮层）

M2区（次级运动皮层）

S1区（体感皮层）都出现了PRV阳性神经元，表明这些皮层区域可能通过多级中枢回路参与了心脏的调控。

在M1（运动皮层）中 M40 区，约有1% 的神经元共表达 EGFP 和 mRFP，意味着：

“这小部分神经元可能通过神经通路同时调节左心室和右心室的活动”，即参与双侧心肌活动的中枢控制。

✅M1（Primary Motor Cortex，初级运动皮层）

位置：大脑背侧皮层，位于中央前区域。

功能：控制随意运动，通过下行皮质-脊髓/脑干通路调节肌肉活动。

在小鼠中还可能影响内脏运动（如心脏调控）。

✅M2（Secondary Motor Cortex，次级运动皮层）

位置：位于M1前方，接近前额叶。

功能：参与运动计划、整合和准备，对复杂运动模式和行为调节起作用。

在啮齿类中也可能与自主神经系统有联系。

✅M40（M1的一个皮层亚区）

属于 M1 的细分区域（皮层地图编号系统中），表示特定功能投射区。

M40在一些脑图谱（如 Allen Mouse Brain Atlas）中位于 M1 的前侧或中间部分。

功能：可能偏向特定身体部位（如心脏）的运动控制。

在本实验中，M40 是发现EGFP 和 RFP 共标记的地方，表明此处神经元可能双侧调控心室功能。

✅S1（Primary Somatosensory Cortex，初级体感皮层）

位置：紧邻M1的后方区域。

功能：负责接收和处理来自身体的触觉、本体感觉、温度等体感信息。

不属于传统意义上的运动调控区域，但可能通过整合感知信息参与某些反射或调节过程。

M1区主要由谷氨酸能神经元构成

M1 是典型的兴奋性皮层区域

figure 2 直接打到特定脑区的病毒，对心脏功能进行检测

c-Fos标记：

c-Fos是一个早期基因的产物，它在神经元活跃时迅速表达。c-Fos 被用作神经活动的标记。

例如，当神经元经历了激活或兴奋时，c-Fos 就会被转录并表达。

因此，c-Fos 作为标记物表明神经元在光遗传学刺激后是被激活的。

Figure 3 通过化学遗传来达到抑制神经元活动的效果

M4Di 受体：

hM4Di是一种化学遗传学工具，属于Gi偶联型受体。这种受体被设计成在**CNO（氯氮平-N-氧化物）**的作用下被激活，抑制神经元的活动。

hM4Di通常用于“抑制”特定神经元的功能，它能通过CNO（氯氮平-N-氧化物 （CNO））的激活，使相应的神经元“沉默”或减少其活动。

光遗传学在激活实验中的优势是其时空精确性和即时反应，使得研究者能够在非常短的时间内激活特定神经元并观察其对心脏等生理功能的即时影响。

化学遗传学更适用于抑制实验，因为它不依赖于光源，可以提供稳定的、长时间的神经元活动抑制。

抑制不用光遗传学-方便-深部脑结构也不受影响，激活不用化学遗传学-实时性较差，激活是很快的事情

化学遗传学

化学遗传学（Chemogenetics）是一种相对较新的技术，通过小分子化学物质与特定的工程化受体相互作用来调控神经元的活动。它是一种结合了基因工程与药物调控的技术，可以精确地调节神经元的激活或抑制。与传统的光遗传学不同，化学遗传学不依赖于光源，而是通过系统性注射或局部应用化学物质（如CNO等）来控制神经活动。这为实验提供了不同的灵活性和可控性。

主要的化学遗传学工具和原理

DREADDs（Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs）：

DREADDs是化学遗传学中最常用的工具。它们是一类通过基因工程改造的G蛋白偶联受体（GPCRs），可以在不受体内天然配体控制的情况下，通过外源性的化学物质来激活或抑制它们的功能。

DREADDs的核心特点是它们可以被特定的小分子药物（通常是CNO或其类似物）激活或抑制，而不受自然配体的影响。常见的DREADDs包括：

hM3Dq（激活性受体）：通过与CNO结合，能够激活下游的G蛋白信号通路，促进神经元的去极化。

hM4Di（抑制性受体）：通过与CNO结合，能够抑制神经元活动，通常通过激活G抑制性信号通路，减少神经元的兴奋性。

作用机制：

激活作用：DREADDs如hM3Dq与CNO结合后，会启动细胞内的信号传导通路，通常是Gq/11通路，增加细胞内钙离子浓度，最终导致神经元的去极化和激活。

抑制作用：DREADDs如hM4Di与CNO结合后，会激活Gi偶联通路，通过减少细胞内的cAMP水平或其他机制来抑制神经元的活动。

与光遗传学不同，化学遗传学的受体可以通过注射或口服给药等方式激活，无需光照。

Figure 4 神经元消除 

特异性消融 M1 区的兴奋性谷氨酸能神经元

1.AAV-EF1α-DIO-taCasp3-TEVp：

这是一个含有双向锁定（DIO, Double-floxed Inverse Orientation）的构建体，编码tandem attenuated Caspase-3（taCasp3）和TEVp（Tobacco Etch Virus protease）。

在没有 Cre 表达的细胞中，这段基因由于被反向插入，不会被表达。

一旦有 Cre 重组酶存在，它会将taCasp3片段翻转到正确方向，从而驱动表达 Caspase-3 和 TEVp，引发凋亡。

2.AAV-CaMKIIα-Cre-GFP：

这是一个只在兴奋性谷氨酸能神经元中（即表达 CaMKIIα 的神经元）表达的 AAV，携带Cre 重组酶和 GFP。

CaMKIIα 启动子具有较强的兴奋性神经元特异性，所以这使得 Cre 仅在这些细胞中表达。

🔬 工作原理总结：

两种病毒共同注射到 M1 区（或其他目标脑区）；

只有在表达 CaMKIIα 的兴奋性神经元中，Cre 才被表达；

Cre 介导 DIO-taCasp3-TEVp 的“解锁”，使 taCasp3 正向表达；

taCasp3 是一种“增强型的 Caspase-3”，在 TEVp 的协助下启动细胞程序性死亡（凋亡）；

最终导致特异性消融 M1 区的兴奋性谷氨酸能神经元。

通过 taCasp3 小鼠中 NeuN （一种成熟神经元标志物） 阳性神经元的缺失证实了 M1 谷氨酸能神经元消融

Figure 5 M1 神经元输入 MnR

AAV（腺相关病毒）→ 标记 M1 神经元、追踪轴突投射；

用途：

标记某类神经元（如谷氨酸能神经元）；

表达荧光蛋白（EGFP、mCherry）来示踪投射；

携带 DREADDs、ChR2 等基因，进行功能操控。

VSV（Vesicular Stomatitis Virus）→ 进行跨突触的顺行追踪

TPH2（Tryptophan hydroxylase 2）：

是 5-HT（血清素）合成的限速酶，是中枢神经系统中血清素能神经元的经典标志物。TPH2 阳性 → 说明是血清素能神经元。

MnR（Median raphe nucleus，中缝核）：

属于脑干的一部分，含有大量血清素能神经元，广泛参与调控睡眠、情绪和心血管活动。

1. AAV1-hSyn-Cre 注射到 M1：

AAV1 型病毒有一定的顺行跨突触转运能力（虽然比 VSV、PRV弱，但可以做到一定程度）。

hSyn 启动子（神经元特异性）保证只在神经元中表达 Cre 重组酶。

因此：M1 的神经元被感染，表达 Cre，同时通过突触把 Cre 转运到它们投射连接的下游神经元。

2. AAV-DIO-ChR2-mCherry 注射到 MnR：

这个病毒带的是一个DIO（Double-floxed Inverted Open reading frame）构建的 ChR2-mCherry，需要 Cre 的存在才能激活表达；

单独注射 DIO-ChR2-mCherry 是不表达的；

只有接收到 Cre 的 MnR 神经元，才能“翻转”基因框架，开始表达ChR2（光敏通道）+ mCherry（红色荧光标记）。

🔹 最终实现了什么？

只激活了：接收来自 M1 投射的 MnR 神经元；

并且这些 MnR 神经元能够在光刺激（蓝光）下通过 ChR2 激活，功能上可以操控 M1 → MnR 的特定回路。

如果只用解剖追踪（如EGFP标记或VSV），只能说明“有连接”；

用钙成像记录光激后的功能响应，才能证明“这些连接是有功能的”——能激活目标神经元。

Figure 6 M1 的 MnR 投射神经元的光遗传学激活影响了心脏功能

分别激活下游的MnR或者M1区域看对心脏功能的影响。

为什么注入麝香酚会阻止效果？

注入麝香酚后，MnR 神经元的活动被过度激活，可能导致MnR 神经回路的过度激活。这种过度激活可能会引起以下几种效果：

过度激活抑制正常回路功能：过度的MnR 神经元激活可能会抑制从M1到MnR 的信号传递。在这种情况下，尽管通过光刺激激活了M1 神经元，但MnR 神经元的过度激活可能干扰了M1 到 MnR 的正常传递信号。

改变自主神经活动平衡：过度的MnR 激活可能破坏心脏功能、血压和自主神经活动的正常调节机制，从而改变了预期的生理响应。

Figure 7 光遗传学激活 M1 兴奋性神经元削弱了 MI 小鼠的心脏功能

加疾病-抑制的实验也做了-我们将 CaMKIIα 启动子驱动的表达 AAV 的 hM4Di 注射到 MI 小鼠的 M1 区，然后结扎左冠状动脉前降支并用 CNO 注射刺激，每天一次，连续 21 天

Figure 8 心梗条件下也要消融-消融 M1 兴奋性神经元可改善 MI 小鼠的心脏功能

Figure 9 MnR 神经元位于 M1 的下游，影响 MI 小鼠的心脏功能

在心梗条件下，基本上把上述不在疾病条件下的做了一个遍。