测序read数会受到基因长度和测序深度影响，解决方案如下：
1、基因长度影响--将测序Read数除以基因长度；2、测序深度影响--将Read数除以总Read数进行标准化

简写

RPM/CPM: Reads/Counts of exon model per Million mapped reads (每百万映射读取的reads)
--本次某个基因read数/本次测序总read数（先对测序深度归一化）

RPKM: Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的reads)
--（某样本特定基因read数 /某样本测序总read数）*10^3 *10^6/ 基因长度 （先对测序深度归一化得到RPM，再对基因长度归一化RPKM）

FPKM: Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments(每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments)
--（某样本特定基因read数 /某样本测序总read数）*10^3 10^62（双端）/ 基因长度（先对测序深度归一化得到FPM，再对基因长度归一化得到FPKM）

TPM：Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts)
--（某样本特定基因read数/基因长度）*10^3 *10^6 /某样本测序总read数（先进行基因长度标准化得到RPK，后进行测序深度标准化得到TPM ）

RPKM

RPKM--代表每百万reads中来自于某基因每千个碱基转录得到的reads数。是将map到基因的read数除以map到基因组上的所有read数(以million为单位)与RNA的长度(以KB为单位)之积。

RPKM计算公式

total exon reads：样本中某个基因mapping到外显子上的所有的reads数

mapped reads (Millions) ：样本总reads数

exon length(KB)：某个基因的长度（外显子长度的总和，以KB为单位）

RPKM公式简化

FPKM

FPKM与RPKM计算方法基本一致。FPKM 计算的是DNA片段(fragments)，也就是一对reads。与RPKM 的差别主要体现在，FPKM在一对reads map上的情况下只计数1，而RPKM 会计为2。适用于双端测序。

FPKM计算公式

在单端测序中，一个Fragments只测一条Reads，所以，Reads数与Fragments数目相等；
在双端测序中，一个Fragments测两端，会得到2条Reads，但由于后期质量或比对的过滤，有可能一个Fragments的2条Reads最后只有一条进入最后的表达量分析。
总之，对某一对Reads而言，这2条Reads只能算一个Fragments，所以，Fragment的最终数目是Reads的1到2倍之间？？

FPKM（RPKM）适用于：同一个样本中基因A和基因B的相对表达量

TPM

TPM：Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts)

TPM计算公式

Ni：比对到第i个exon的reads数

Li：第i个exon的长度

sum(N1/L1+N2/L2 + ... + Nn/Ln)：所有 (n个)exon按长度进行标准化之后数值的和

TPM其实跟RPKM，FPKM也很相似。TPM唯一不同的地方就是计算次序不一样。所以，当计算TPM的时候，先对基因长度进行归一化，其次是测序深度的归一化。然而，归一化次序不一样，对结果影响差别就很大。当使用TPM时候，每个样本的TPM总和是一样的（=10^6）。这使得比较同一个基因的reads数在不同样本间的比例变得容易。FPKM和RPKM与此相反，每个样本的FPKM或RPKM的累加和可以不一样，造成样本间不能直接比较FPKM或RPKM值。