1. Author

金奇

金奇，中国医学科学院研究员，北京协和医学院长聘教授，国家杰出青年基金获得者，国家级高层次人才项目获得者，中国医学科学院学术咨询委员会学部委员。先后毕业于北京医学院（获得医学学士学位）、中国预防医学科学院（获得医学博士学位），并在美国国立卫生研究院和美国联邦疾病预防与控制中心从事博士后研究。担任过病毒基因工程国家重点实验室主任、卫健委病原系统生物学重点实验室主任和中国医学科学院结核病研究中心主任等；中国医学科学院病原生物学研究所所长、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所副所长；国家“863计划”基因操作与蛋白质工程技术主题专家组组长、国家“973计划”传染病专题专家组组长、国家重大传染病防治重大科技专项结核病领域专家组组长及中国疾病预防控制中心首席专家；中华医学会医学病毒学分会主任委员和中国防痨协会标准化专业分会主任委员等。

2. Background

2.1 流感病毒病毒学特征

甲型流感病毒（InfluenzaA virus）是正黏病毒科（Orthomyxoviridae）的重要病原体，其病毒学特征复杂且具有高度变异性。以下是其主要病毒学特征：

1. 病毒结构

基因组：单股负链RNA病毒，基因组由8个节段组成（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS），每个节段编码不同蛋白。分节段的特点使病毒易通过基因重配（Reassortment）产生新亚型。

病毒颗粒：多形性（球形或丝状），直径约80-120 nm。核心为核糖核蛋白复合体（RNP），外包脂质双层膜（来自宿主细胞）。

表面蛋白：血凝素（HA）：介导病毒与宿主细胞唾液酸受体结合，促进膜融合。神经氨酸酶（NA）：水解唾液酸，帮助病毒从细胞释放。HA和NA是主要抗原，也是亚型分类的依据（如H1N1、H3N2等）。

2. 抗原特性

抗原漂移（Antigenic Drift）：HA或NA的点突变积累导致小幅度变异，引起季节性流行。

抗原转变（Antigenic Shift）：不同亚型病毒在宿主内发生基因节段重配，产生全新HA/NA组合（如H1→H5），可能导致大流行。

3. 宿主范围与传播

自然宿主：野生水禽（如鸭、雁）是主要储存宿主。跨种传播：可感染家禽、猪、马、海豹等，偶尔感染人类（如H5N1、H7N9）。传播途径：飞沫、气溶胶、接触污染物。

4. 复制周期

吸附与侵入：HA结合宿主细胞唾液酸受体（α-2,3或α-2,6链接，决定宿主特异性）。内吞与融合：通过内体酸化触发HA构象变化，释放病毒RNA至细胞质。基因组复制：病毒RNA在核内转录/复制，依赖病毒RNA聚合酶（易出错，导致高突变率）。装配与释放：新病毒颗粒在细胞膜出芽，NA协助释放。

5. 变异与进化

高突变率：RNA聚合酶缺乏校对功能，导致高频点突变。人兽共患潜力：猪作为“混合器”，可同时感染人/禽流感病毒，促进重配（如2009年H1N1大流行株）。

6. 实验室检测

PCR：检测病毒RNA（金标准）。抗原检测：快速试纸（灵敏度较低）。病毒培养：MDCK细胞或鸡胚分离病毒。血清学：检测抗体滴度（如HI试验）。

3. Methods

1. 噬菌体库的建立

2. ELISA

3. HA与NA的蛋白表达

4. 免疫荧光实验

5. IgG1的表达纯化

6. 血凝实验

7. 中和实验

8. 定点突变

9. 动物预防与保护实验

4. Results

实验团队以感染了H7N9的康复患者的外周血为样本，构建了噬菌体展示库。在这个库中，包括了1.2 E8-1.7 E8个克隆。经过三轮淘洗之后确定得到18个克隆——6个来自于VH3家族，12个来自VH4家族。作者将其分为4组，组1：VH3+VL1；组2：VH4+VL1；组3：VH3+VL3；组4：VH4+VL1。在ELISA实验中，第1组的mAb表现出NA结合活性；第3组mAb能够与人类和鸟类H7 HA相互作用； 第4组mab识别人类H7 HA，但没有鸟类H7。 为了进一步表征18个mAb的结合特异性，在293T细胞中表达了病毒HA和NA蛋白。 使用免疫荧光测定（IFA）测试了这些蛋白与mAb的结合亲和力。 结果与使用ELISA检测获得的结果一致。

18个单克隆抗体的序列及中和信息

第4组mAB在细胞上表现出对H7N9病毒的明显中和活性。 但是，对于3组抗体，很少检测到中和活性。对于第1组或第2组抗体，没有发现可检测到的中和活性。在第4组中，两个Fab表现出更强的中和活性，并转化为名为HNIgGA6（H7N9Fab12）和HNIgGA6B5（H7N9Fab17）的全长IgG1分子，以进行进一步研究。两个mAb都表现出强大的HI活动。  HNIgGA6的HI滴度低至0.8 mg/ml，而HNIgGA6B5为1.6 mg/ml。 然后在细胞上确定它们针对活的H7N9病毒的中和活性。

人类H7 HA和Avian H7 HA之间有七个氨基酸差别。构建了人类H7 HA的七个突变体，每次将七个氨基酸之一的一种变为鸟类H7 HA中的相应氨基酸。检测所有突变体发现只有V186G或L226Q消除了结合活性。 为了进一步确认这些发现，禽类H7 HA在同一位置被反向突变。 这些构建体也在细胞中表达，并通过IFA检测。如预期的那样，仅当突变G186V和Q226L都引入禽类H7

HA时，结合活性中的逆转。此外还可以通过梯度稀释后抗体压力筛选突变株，发现5代以后能够稳定存活的突变株普遍携带V186G和L226Q突变。在后续的小鼠保护与预防实验中显示，剂量为20mg/kg时，能够起到很好的保护作用。

V186G和L226Q突变能够降低抗体结合效率

5. Discussion

作者：Zhe Chen

通讯作者：Qi Jin

单位：MOH Key Laboratory of SystemsBiology of Pathogens, Institute of Pathogen Biology, Chinese Academy of MedicalSciences and Peking Union Medical College, Beijing, China.

年份：2015.03.30

期刊：Nature communications

科学问题 ：H7N9康复者体内是否存在强效中和抗体？

讨论：由于感染的严重程度，H7N9流感A型流感病毒亚型引起了严重的全球健康问题，并且由于人类的死亡率约为25％。 到2014年9月，总共有454例H7N9病例报道了171例死亡。迫切需要一种有效的针对H7N9感染的抗病毒疗法据我们所知，据报道与H7反应的唯一中和抗体是CR8020，它对大多数Group2流感病毒存在中和活性。不幸的是，CR8020对最近的H7N9病毒中和能力低。 在这项研究中从H7N9感染中康复者的血液中筛选了该中和抗体。 两种抗体在体外和体内能够中和H7N9病毒。

HA是相同亚基的三聚体，每个亚基都包含两个由单个前体的蛋白水解裂解产生的多肽。每个HA单体都包含其球形头部的RB，该RB负责病毒受体识别和相互作用，几种保守的氨基酸（98y，153W，153W，183h和195y），以及其边缘的三个保守的二级结构。一般来说，禽病毒更喜欢在a-2,3链中与半乳糖结合唾液酸，而人类病毒更喜欢结合a-2,6连接的唾液酸。 除了其在受体结合中的作用外，HA还通过诱导通过其茎区域诱导膜融合进入细胞。使用IFA检测，发现两个已鉴定的抗体都与病毒HA蛋白相互作用，但与NA不相互作用。 进一步的分析表明，RBS基序对于中和抗体与HA的结合至关重要。RBS V186G或L226Q中的两个氨基酸残基取代中的两个导致人H7 HA结合能力的丧失。它通过RBS与HA蛋白结合并通过RBS与HA蛋白结合，并与其识别并与人类细胞受体的识别并互动。先前报告：识别球形头部的中和抗体表现出强大的HI活性，而中和抗体的中和抗体通常不会表现出这种活性。本实验结果与这些发现是一致的，因为HNIgGA6和HNIgGA6B5都表现出有效的HI活动。总之，中和抗体的表征为186V和226L在病毒 - 受体相互作用中的基本作用提供了进一步的支持。此外，这些结果为开发新型中和抗体提供了见识。 与球形头部反应的抗体相比，与与流感病毒的茎区结合的抗体，病毒中和所需的中和抗体浓度通常要低得多。186V和226升的基本作用限制了它们的变化和随之而来的抗原漂移，

小鼠模型中评估了HNIgGA6和HNIgGA6B5的抗病毒作用。 用1-10mgkg的HNIGGB5预防1-10mgkg 1赋予小鼠免受H7N9感染的100％保护，而HNIgGA6赋予了较低的保护水平。如体重恢复所示，感染小鼠的健康也得到了显着改善。

在11例测试的患者中，有2例在N9中赋予对oseltamivir和Zanamivir的耐药性的R292K突变。在测试过程中还检测到R152K突变。 该突变在体外表现出对Zanamivir和Oseltamivir的轻度抗性。中和抗体，例如直接在残基186V和226L处攻击HA蛋白的HNIGGA6和HNIGGB5提供了另一种H7N9治疗。 即使可能逃脱，与其他已建立的疗法一起使用以减少病毒逃生或抗性的前景时，被动免疫也可能非常有效。