引言

作为长期深耕金属结合蛋白（MBPs）领域的博士生，踩过不少技术选择的坑 —— 最初面对 X 射线晶体学、NMR、ICP-MS 等一堆方法无从下手，后来接触到北大团队开发的 METAL - TPP 新兴技术，才慢慢摸清不同场景下的最优解。今天把自己整理的研究笔记分享出来，从传统技术到前沿方法，从技术细节到实验策略，帮同为研究者的你少走弯路。

一、传统技术：经典方法的核心价值与实操优化

传统技术之所以至今仍不可替代，在于它们在特定研究场景下的精准性 —— 比如原子级结构解析、定量分析等，关键是要摸透其核心逻辑和优化技巧。

1. 结构生物学技术：原子级结合位点的 “显微镜”

如果你的目标是解析金属结合位点的三维结构（配位数、键长、空间构型），优先选这两种方法：

▶ X 射线晶体学：结构解析 “金标准”，分辨率 0.5-2 Å，能直接观察金属配位环境。局限是需高质量晶体（耗时数周至数月），难适用于膜蛋白等难结晶蛋白。

【优化技巧】优先选择稳定的蛋白质复合物，耐心优化结晶条件，必要时通过定点突变提高蛋白稳定性。

▶ NMR 波谱：无需结晶，溶液状态下即可研究，能提供结合动态信息（如解离动力学），适合 < 40 kDa 的中小分子量蛋白。局限是需高浓度样品（0.1-1 mM），大分子信号易重叠。

【优化技巧】控制样品纯度在 95% 以上，避免高粘度缓冲液，顺磁性金属离子样品需缩短实验时间。

2. 光谱与互作分析技术：快速定性定量

这类技术适合快速判断结合与否、分析结合强度，操作便捷：

▶ 电子顺磁共振（EPR）：针对顺磁性金属离子（Cu²⁺、Fe³⁺等），灵敏度达 nM 级，能区分金属氧化态。局限是需低温（77 K），仅提供局部环境信息。

【优化技巧】样品需新鲜制备，避免氧化，严格控制低温条件以减少信号损失。

▶ 荧光偏振（FP）：高通量筛选利器，样品消耗量仅 μL 级，可测结合常数（Kd），覆盖 nM 至 μM 级亲和力。局限是需荧光标记，受温度、粘度影响大。

【优化技巧】统一实验温度（建议 25℃），选择合适的荧光标记位点，避免影响蛋白结合活性。

▶ 表面等离子体共振（SPR）：无标记实时检测结合动力学，能同时获得 Ka、Kd、Kon 等参数，我验证候选蛋白与金属离子的相互作用时常用它，比如测得多肽与 Zn²⁺的 Kd 值为 2.02×10⁻⁷ M。但仪器成本高，样品纯度要求高（>90%）。

【优化技巧】芯片表面配体固定密度控制在 1000-5000 RU，运行缓冲液含 0.05% Tween-20 减少非特异性结合。

▶ 等温滴定量热（ITC）：直接测定热力学参数（ΔH、ΔS、ΔG），无需标记，结果直观可靠。适合验证强相互作用（Kd < 1 μM），但样品需求量大（mg 级），检测周期长

【优化技巧】蛋白与金属离子浓度比控制在 1:10，实验温度 25℃，预实验确定合适浓度范围。

3. 质谱技术：MBPs 鉴定与定量的 “精准秤”

想知道蛋白是否结合金属、结合比例多少，质谱技术是核心手段。

▶ 电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）：元素特异性强，检测限低至 pg/mL 级，可同时分析多种金属，但它不能直接提供蛋白序列信息，需与分离技术联用。

【优化技巧】实验器材优先选聚丙烯材质，避免玻璃器皿溶出金属，样品前处理严格防污染。

▶ Native MS（非变性质谱）：能保留蛋白 - 金属复合物的天然构象，直接测分子量和结合计量比，比如锌指蛋白与 Zn²⁺的 1:1 或 1:2 结合比例，用它能轻松区分。但仪器成本高，不稳定复合物难检测。

【优化技巧】优化电离条件，降低离子源温度，避免复合物解离。

4. 分离纯化技术：MBPs 富集的 “提纯神器”

拿到高纯度的目标蛋白，后续实验才能顺利开展，这两类色谱技术是常用方案。

▶ 固定化金属亲和色谱（IMAC）：重组 MBPs 纯化标配，His-tag 与 Ni²⁺-NTA 树脂结合力强，纯化效率≥95%。局限是存在非特异性结合，金属离子可能泄漏。

【优化技巧】根据组氨酸含量选金属离子（高含量用 Zn²⁺，低含量用 Cu²⁺），缓冲液 pH 控制在 7.0-8.0，避免 EDTA、DTT 等螯合剂，洗脱用 10-500 mM 咪唑梯度。

▶ 金属螯合色谱：适合天然 MBPs 分离，无需基因改造，选不同金属离子就能优化选择性。比如用 Cu²⁺- 螯合柱能特异性富集血清白蛋白。缺点是分辨率低，常需与其他技术联用。

【优化技巧】通过调节 pH 和离子强度提高选择性，避免使用强螯合剂洗脱液。

二、新兴技术：METAL-TPP 带来的全蛋白质组筛选革命

当传统技术难以实现全蛋白质组范围的 MBPs 筛选时，北大团队开发的 METAL-TPP（发表于《Nature Chemical Biology》）提供了权威解决方案，让全局无偏筛选成为可能。

核心原理与权威验证

▶ 核心逻辑：金属结合会提升蛋白热稳定性，用 EDTA、TPEN 等螯合剂剥夺金属后，MBPs 因失去配体而热稳定性下降（Tm 值降低），对比两组热稳定性差异 + 定量质谱，即可筛选潜在 MBPs。

▶ 顶刊验证：北大团队用 3 种已知 MBPs 和非 MBP 对照验证，仅 MBPs 的 Tm 值显著降低（证实特异性）；在 HeLa 细胞中筛选出的热稳定性下降蛋白中，82% 是已知 MBPs，且对不同金属无偏好（证实可靠性）。

优势与局限

▶ 优势太突出：全蛋白质组无偏筛选（一次鉴定数百至数千种 MBPs），无需标记，接近生理条件，能捕捉弱相互作用（Kd > 1 μM），假阳性率低，适配多种样本类型。

▶ 局限也明显：依赖高分辨率定量质谱仪（如 Orbitrap），数据解析需要 TPP - 2D、TPP - R 包等专用工具，需后续实验验证直接相互作用。

关键操作要点（参考顶刊标准流程）

想做好 METAL-TPP，这几点不能忽视：

1. 样品制备：用非变性裂解液，超声破碎控制功率，BCA 法定量，SDS-PAGE 验证无明显降解；

2. 实验设计：实验组加 1-5 mM EDTA（需预实验优化），对照组加等体积 PBS，设置 8-10 个温度梯度（37-66℃，覆盖 90% 人类蛋白 Tm 范围）；

3. 数据分析：MaxQuant 定量后用 VSN 算法归一化，TPP - 2D 拟合熔解曲线，筛选阈值设为 FDR＜0.05 且 ΔTm＞1.5℃；

4. 验证步骤：筛选出的候选蛋白需用 ICP-MS、SPR 或 ITC 验证直接结合。

三、技术对比与实验策略：按研究目标选对方法

很多时候不是技术不好用，而是没选对场景。我整理了核心技术参数对比和决策路径，帮你快速匹配需求：

实验策略决策路径

1. 想发现新型 MBPs：优先选 METAL-TPP（全蛋白质组无偏筛选），或 IMAC + 质谱（富集后鉴定）；

2. 想解析结合位点结构：X 射线晶体学（静态高分辨率）或 NMR（动态结构）；

3. 想定量结合亲和力与动力学：SPR（实时无标记）或 ITC（热力学参数）；

4. 想确定结合计量比：Native MS（完整复合物）或 ICP-MS（元素定量）；

5. 想研究动态结合过程：NMR（毫秒 - 微秒级）或 SPR（实时监测）；

6. 想验证 TPP 筛选结果：ICP-MS（金属结合验证）+ SPR（直接相互作用）。

技术联用技巧

单一技术往往不够全面，合理联用能事半功倍：

▶ METAL-TPP + ICP-MS + SPR：筛选候选 MBPs→验证金属结合→确认直接相互作用，形成完整证据链；

▶ IMAC + X 射线晶体学：纯化高纯度蛋白用于结晶，提升结构解析成功率；

▶ NMR + EPR：全局结构 + 局部配位环境，完整揭示结合机制；

▶ METAL-TPP + 机器学习：北大团队已证实该组合能系统发现金属结合蛋白，减少实验盲目性。

四、我的研究心得

1. 防污染是基础：金属结合实验对污染极敏感，一定要用超纯试剂、无金属水，器材选聚丙烯材质，避免金属器械接触样品；

2. 技术没有 “高低档”：传统技术的精准性和新兴技术的高通量互补，比如用 TPP 筛选后，必须用 ICP-MS 或 SPR 验证，才能确保结果可靠；

3. 优化比选择更重要：同一技术，参数优化到位能让结果天差地别 —— 比如 METAL-TPP 的温度梯度设置、EDTA 浓度，IMAC 的金属离子选择、缓冲液 pH；

4. 关注弱相互作用：很多生理相关的结合是低亲和力（Kd > 1 μM），传统方法易遗漏，而 METAL-TPP 能有效捕捉，别轻易忽略这类相互作用的生物学意义；

5. 参考顶刊 protocol：新手可直接借鉴北大团队、复旦大学团队的已发表流程，关键参数标注文献依据，能少走 90% 弯路。

研究 MBPs 的过程，就是不断在技术中寻找平衡的过程。希望这篇笔记能帮你少踩坑，更快找到适合自己研究的技术路线。如果有具体实验场景的疑问，也欢迎在评论区交流～

👉  首个蛋白质组水平无偏倚靶点筛选方法

▶ 全面直接筛选真实药靶组合：蛋白质组水平筛选药物结合的蛋白靶点，全面覆盖治疗靶点与脱靶靶点；使用药物分子本体进行试验，无需设计合成分子探针，药靶结合更真实

▶ 多种数据分析策略：结合蛋白热变性曲线分析和非参数分析方法（NPARC），全面捕获潜在药物靶点

▶ 多种生信分析数据库挖掘辅助筛选：对潜在药物靶点进行生信分析与数据库挖掘，辅助最终药物靶点的确认

▶ 多种衍生技术可选：除常规温度范围（TPP-TR）、药物浓度范围（TPP-CCR）、两者结合（2D-TPP）的常规热蛋白组分析方法外，还可进行单温度点（ITSA）、多温度点混合（PISA）等高通量热蛋白组分析方法

参考资料

[1] Zeng X, Wei T, Wang X, et al. Discovery of metal-binding proteins by thermal proteome profiling. Nat Chem Biol. 2024;20(6):770-778. doi:10.1038/s41589-024-01563-y

[2] Handing KB, Niedzialkowska E, Shabalin IG, et al. Characterizing metal-binding sites in proteins with X-ray crystallography. Nat Protoc. 2018;13(5):1062-1090. doi:10.1038/nprot.2018.018

[3] Janisse SE, Fernandez RL, Heffern MC. Characterizing metal-biomolecule interactions by mass spectrometry. Trends Biochem Sci. 2023;48(9):815-825. doi:10.1016/j.tibs.2023.06.006

[4] Liu Y, He B, Liu L, et al. Fasten the analysis of metal-binding proteins with GE-ICP-MS via increasing the electrolyte concentration of the running buffer. Talanta. 2024;266(Pt 2):125047. doi:10.1016/j.talanta.2023.125047

[5] Young TR, Xiao Z. Principles and practice of determining metal-protein affinities. Biochem J. 2021;478(5):1085-1116. doi:10.1042/BCJ20200838

Coverdale JPC, Polepalli S, Arruda MAZ, et al. Recent Advances in Metalloproteomics. Biomolecules. 2024;14(1):104. Published 2024 Jan 13. doi:10.3390/biom14010104