在上一期（三代测序技术100问（1）：NGS与第三代测序，如何做出明智选择？）中，我们厘清了二代与三代测序技术的适用边界，明确了选择需“因题施策”。然而，踏入三代测序的大门，新的抉择又摆在面前：目前市场上主流的长读长技术平台主要由两大阵营引领——美国的PacBio（Pacific Biosciences）和英国的ONT（Oxford Nanopore Technologies）。它们的技术原理、性能特点和应用侧重各有千秋，常常让研究者们，特别是准备首次尝试三代测序的团队感到选择的困惑。

我们继续邀请到在山东第一医科大学李冕博士（PS. 三代测序技术和仪器发烧友），为大家深入剖析这两大平台的特性，帮助大家在PacBio和ONT之间做出更明智的选择。

两大技术流派：荧光 vs 电流，各显神通

“要理解如何选择，首先得明白它们是怎么‘读’DNA的，”李博士谈到，“尽管目标都是获取长读长序列，但PacBio和ONT实现的方式截然不同。”

PacBio SMRT测序：捕捉聚合酶的“舞步”

PacBio采用的是单分子实时（Single Molecule, Real-Time, SMRT）测序技术。其核心在于观察单个DNA聚合酶在合成互补链时的行为。当带有荧光标记的碱基（dNTP）被掺入新链时，会发出特定颜色的光信号，被高灵敏度检测器捕捉，从而实时读取碱基序列。近年来，其环形一致性测序（Circular Consensus Sequencing, CCS）模式，通过对同一DNA分子进行多次环状测序并整合信息，能够产出高保真（HiFi）读长，这是PacBio的一大杀手锏。

ONT纳米孔测序：感知DNA的“穿行”

ONT的技术则完全不同。它利用生物工程改造的纳米孔蛋白嵌入特殊膜中。当单链DNA/RNA分子在电场驱动下穿过纳米孔道时，不同的碱基（或碱基组合）会对孔道内的离子电流产生特征性的扰动。通过实时监测这些电流信号的变化，并借助复杂的算法进行解码（basecalling），就能推断出通过的碱基序列。这种方式原理上对读长没有限制，能读多长，取决于你提供的DNA片段有多长。

性能对决：准确度、读长、速度与成本的权衡

了解了基本原理，我们再来看看大家最关心的性能指标：

PacBio：精度优先，读长适中

• 核心优势： 高准确度。其HiFi reads的平均碱基质量（QV值）通常能稳定在Q30以上（错误率低于千分之一），甚至逼近Q35，这对于需要精确识别单核苷酸变异（SNP）或进行高质量基因组组装的应用至关重要。
• 读长表现： HiFi reads的平均读长目前在15-25kb范围，虽然逊于ONT的极限读长，但对于绝大多数基因组组装和全长转录本分析已足够优秀。
• 实验要求与周期： 对样本纯度、完整性要求较高，DNA起始投入量相对较大。建库加上机测序的整体流程通常需要约2天时间。

ONT：长度惊人，灵活快速

• 核心优势： 超长读长与灵活性。理论上无读长上限，已报道的最长读长超过4Mb（400万碱基），这对于解析基因组极端复杂区域（如着丝粒）和超大结构变异具有独特优势。建库流程快速（可短至半天），DNA投入量要求低，且支持实时数据产出和分析，测序过程可随时中止，提供了极大的实验灵活性。便携式设备（如MinION）甚至支持野外现场测序。
• 准确度考量： 原始读长的准确度曾是其短板，但随着技术迭代（如最新的R10.4.1流体芯片配合更优化的碱基识别算法如Dorado），其平均碱基质量已提升至Q20+（错误率约百分之一）水平。虽然与PacBio HiFi仍有差距，但在许多应用中已足够，且可通过增加测序深度或结合二代数据进行校正。
• 成本因素： 相对而言，ONT的测序成本（尤其是单位数据量成本）通常更低，对预算有限的实验室更具吸引力。

应用场景导航：你的研究需要什么？

基于上述特点，李博士给出了清晰的选择建议：

优先考虑PacBio HiFi的情形：

• 对碱基级别准确度有苛刻要求的应用：如临床级别的遗传病诊断、肿瘤体细胞突变检测、精确的SNP和InDel鉴定。
• 追求高质量参考基因组组装，特别是需要低错误率来确保基因注释准确性的项目。
• 精细的全长转录本分析，需要准确区分高度相似的isoforms。

优先考虑ONT的情形：

• 对时效性、快速响应要求高的场景：如病原体快速鉴定与监测、疫情追踪、野外环境样本测序。
• 研究目标侧重于超长读长能带来的独特信息：如解析基因组高度重复区域、复杂结构变异、染色体级别的单倍型分型。
• 对准确度要求相对宽松，或可以通过其他方式弥补的应用。
• 需要直接检测RNA修饰的研究（ONT是目前唯一能大规模直接测RNA的技术）。
• 预算有限，但确实需要长读长信息的实验室。

结语：动态评估，适者生存，亦可“混搭”

“需要强调的是，三代测序技术仍在飞速发展，无论是PacBio还是ONT，其性能指标（准确度、读长、通量、成本）都在不断优化。”李博士总结道，“今天的选择建议是基于现阶段的技术水平。在做决策时，务必关注最新的技术进展和发布。”

同时，他也提醒大家，现阶段三代测序的成本相较于二代仍然较高。因此，结合具体的应用场景、预算限制以及对技术更新的预期进行综合评估至关重要。在某些情况下，甚至可以考虑设计PacBio和ONT的混合测序策略，或者三代与二代结合的策略，取长补短，以最高效、经济的方式达成研究目标。

最终，选择PacBio还是ONT，并非一道简单的对错题，而是一个需要根据自身研究“量体裁衣”的过程。希望今天的解析，能为你在这条技术选择的岔路口，点亮一盏明灯。

下一问预告：了解了平台选择，我们接下来将深入探讨三代测序商业化服务如何选择。敬请关注《三代测序100问》的后续篇章！