一代测序技术详解：从原理、历程到仪器与应用

1. 发现历程

        一代测序技术起源于20世纪70年代，标志着DNA序列分析时代的开启。

 □ 1975年：英国生物化学家弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger） 与同事开创了链终止法（Sanger法）。

□ 1976-1977年：几乎同时，艾伦·马克西姆（Allan Maxam）和沃尔特·吉尔伯特（Walter Gilbert） 发展了化学降解法（Maxam-Gilbert法）。

□ 1977年：Sanger团队采用链终止法完成了噬菌体ΦX174的全基因组测序（全长5375个碱基），这是第一个被完全测序的基因组。

□ 1980年：Sanger和Gilbert因在DNA测序方法上的贡献共享诺贝尔化学奖（Sanger的第二座诺贝尔奖）。

□ 1986年：Applied Biosystems公司推出了首台自动化荧光测序仪，采用毛细管电泳和荧光标记替代放射性标记与平板凝胶，大幅提升了测序效率与自动化水平。

        在长达30多年的时间里，Sanger测序是主流技术，为人类基因组计划（1990-2003）贡献了超过70%的序列数据，被誉为测序技术的"金标准"。

2. 一代测序的原理

        Sanger测序的核心是双脱氧链终止法。其关键在于利用 2',3'-双脱氧核苷酸（ddNTPs） 作为链终止剂。

关键组分：

模板DNA：待测序的单链DNA。

引物（Primer）：与模板3'端互补的短链 oligonucleotide。

DNA聚合酶：催化DNA新链的合成。

脱氧核苷三磷酸（dNTPs）：合成DNA的基本原料（dATP, dTTP, dCTP, dGTP）。

双脱氧核苷三磷酸（ddNTPs）：链终止剂。ddNTP的核糖3'位缺少羟基，一旦掺入正在合成的DNA链，因无法形成磷酸二酯键，链延伸便会终止。四种ddNTP（ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP）通常用不同的荧光染料标记。

过程简述：

1）分反应：将包含模板、引物、DNA聚合酶、dNTPs的反应混合物分装至四个独立反应管中。

2）链延伸与随机终止：在每个反应管中分别加入少量四种之一荧光标记的ddNTP。DNA聚合酶以引物为起点延伸新链，通常掺入dNTP使链继续延伸，但会随机掺入ddNTP，导致合成反应在该点终止。

3）产物：每个反应管中产生一系列长度不同但3'末端均为同一种ddNTP的DNA片段。片段长度取决于ddNTP掺入的位置。

4）分离与检测：将所有反应产物进行毛细管电泳，按长度分离。最短的片段最先到达检测窗口，激光激发荧光标记，检测器根据荧光颜色确定末端碱基类型。

3. 一代测序仪的种类与发展

    一代测序技术从最初的手工操作、放射性标记发展到自动化、荧光标记的仪器系统。

发展阶段特点代表性仪器/系统

1） 早期手动系统基于平板凝胶电泳，使用放射性同位素（如³²P）标记，需放射自显影，操作繁琐、耗时且危险。无特定商业型号，多在实验室自行搭建。

2） 自动化荧光测序仪采用毛细管电泳替代平板凝胶，荧光标记替代放射性标记，实现了更高通量和自动化操作。ABI PRISM 3700, 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems)

3） 当代系统进一步优化了通量、速度和自动化程度，集成液体处理系统，支持96孔或384孔板高通量操作。ABI 3130xl, 3500xl系列 (Applied Biosystems)

4） 最新研发进展致力于实现全自动化，减少手工操作，旨在提升在特定领域（如肿瘤研究）应用的便捷性和效率。清华大学正在研发的全自动一代测序仪（2025年投放市场）。

        ABI PRISM系列：Applied Biosystems（现为Thermo Fisher Scientific一部分）的3700和3730xl等型号是人类基因组计划的主力机型，实现了高通量、自动化测序。

        后续型号：如3130xl、3500xl系列，进一步提高了通量、速度和可靠性，广泛应用于各类测序项目。

        研发中的新仪器：据2025年报道，中国工程院院士程京所在的清华大学团队正在研发新一代的一代测序仪器，旨在实现全自动化，解决当前一代测序在肿瘤研究等应用中"手工操作比较多"的缺点，并计划于2025年投放市场2。

4. 首次应用

        Sanger测序的首次重大应用是1977年完成噬菌体ΦX174基因组的全序列测定1。这不仅验证了Sanger法的可行性，也首次揭示了一个生物体的全部遗传密码，开启了基因组学时代。

5. 实验步骤（以现代自动化荧光测序为例）

1）模板制备：

提取纯化高质量的DNA（如质粒、PCR产物）。PCR产物通常需纯化以去除残留的引物、dNTPs和酶。

2）测序反应：

进行循环测序反应（不对称PCR）。反应体系包含：模板DNA、测序引物、荧光标记的ddNTPs、dNTPs、耐热DNA聚合酶（如BigDye®）。

反应在热循环仪中进行（变性-退火-延伸，循环25-40次），生成荧光标记的、长度不一的DNA片段。

3）产物纯化：

反应完成后，纯化以去除未掺入的染料终止子、盐离子等干扰电泳的杂质。

4）上机测序：

将纯化后的产物注入自动化测序仪的样品板。

仪器通过毛细管电泳按长度分离DNA片段。

5）数据采集：

片段经激光检测窗口时，末端的荧光染料被激发发出特定波长的光。

检测器捕获荧光信号，计算机软件将信号转换为序列数据。

6. 结果分析

        测序仪配套软件会自动将荧光信号转化为序列数据（色谱图/峰图）并进行初步分析。

色谱图解读：

     X轴：时间（对应片段长度/碱基位置）。

    Y轴：荧光信号强度。

    峰：每个峰代表一个碱基，颜色与碱基类型对应（如绿-A、红-T、蓝-C、黑-G）。

    Base Calling：软件将一系列峰翻译成碱基序列（ATCG...）。

质量评估与校对：

        评估峰形质量（尖锐、单一、基线平整、分离清晰）。

        序列首尾部分（约10-20个碱基）质量通常较差，需修剪。

        常见问题：套峰（可能源于PCR错误、样品不纯或引物非特异结合）、信号衰减（序列后端信号弱）。

序列比对与应用：

        使用BLAST等工具与数据库中的参考序列比对，确认序列身份。

        应用于验证（如克隆、CRISPR编辑、PCR产物）、发现突变（SNP、点突变）、单倍型分析等。

7. 技术特点与评价

特点描述

优点- 读长长：可达800-1000bp，甚至更长。

- 准确性高：原始准确率高达99.99%，是黄金标准。

- 技术成熟：流程标准化，应用广泛。

缺点- 通量低：一个反应通常只能得到一个序列。

- 成本高：按每Mb数据计算，成本远高于下一代测序（NGS）。

- 耗时：不适合大规模基因组测序。

当前应用场景尽管高通量测序（NGS）已成为主流，但Sanger测序因其高准确性，在以下领域不可或缺：

1. 验证NGS结果（如特定突变）。

2. 克隆鉴定（质粒测序）。

3. 微生物菌种鉴定（如16S rRNA测序）。

4. 法医学和亲子鉴定（STR位点测序）。

5. 肿瘤研究（仍是经典选择，尤其配合新研发的全自动仪器）。

总结

        一代测序（Sanger测序）是一项划时代的科学技术，为我们解读生命遗传密码提供了第一把、也是极其精准的一把钥匙。从手工操作到自动化仪器，从放射性标记到荧光检测，一代测序技术本身也在不断演进。尽管如今高通量测序技术大放异彩，但Sanger测序因其无可比拟的准确性和长读长优势，在现代分子生物学实验室中，尤其是在验证性测序和临床诊断的黄金标准应用方面，依然扮演着不可替代的角色。新一代全自动一代测序仪的研发也预示着这项技术将继续焕发活力。